一步法RT-qPCR 试剂盒（含UDG）

One-Step RT-qPCR Probe Kit（UDG plus）

一步法RT-qPCR 试剂盒（含UDG）

 

Cat.No.：ZQP02

储存温度：-25 ~ -15 ℃保存

 

 

 

1.产品描述

One-Step RT-qPCR Probe Kit 适用于RNA样品（如RNA病毒）的定量检测。在单管内，RNA首先通过逆转录酶逆转录为cDNA，然后通过DNA聚合酶扩增，从而实现定量PCR（qPCR）检测。该预混液将RT-qPCR所需的Reverse Transcriptase、 Taq DNA聚合酶和RNase Inhibitor整合至一管中，加样方便、简单，无需额外的开盖/移液操作，提高了检测通量，降低了污染风险。同时引入dUTP/UDG防污染系统，避免之前扩增产物所造成的气溶胶等污染，热敏（Heat-labile）UDG在逆转录（50-55 ℃）时迅速失活，不会影响qPCR性能。提供的2×U⁺ Buffer中包含dNTPs（dUTP plus）和Mg²⁺，经优化后适用于多种检测方法。

 

2.产品组分

组分	ZQP02-01 （100 rxns）	ZQP02-02 （1000 rxns）	ZQP02-03 （5000 rxns）
2× One-Step U+ Buffera	1.3 ml	13 ml	65 ml
One-Step Enzyme Mixb	130 μl	1.3 ml	6.5 ml
RNase-free ddH2O	1.3 ml	13 ml	65 ml

a.包含dNTPs（dUTP plus）和Mg²⁺。

b.包含Reverse Transcriptase、Taq DNA polymerase、RNase inhibitor和Heat-labile UDG。

 

3.质量控制

• ►无核酸内切酶、外切酶和RNase残留。
• ►功能检测：可检测pg级的RNA样品。

 

4.注意事项

• ►样品使用前请混匀并瞬时离心至反应管底部。
• ►Enzyme Mix中含有高浓度的甘油，吸取时需注意准确吸取。
• ►实验过程中注意洁净，并使用RNase-free、DNase-free的枪头、EP管等。

 

 

5.RT-qPCR实验流程（举例）

（1）配制如下反应混合液

组分	体积
RNase-free ddH2O	To 25 μl
2× One-Step U+ Buffer	12.5 μl
One-Step Enzyme Mix（UDG plus）	1.25 μl
Primer/Probe Mix（7.5/2.5 μM）	1 μl
模板DNA	X（Total RNA：1 pg - 1 μg）

注意：

1. 1)通常体系中引物终浓度为0.3 μM，可根据实验需求在0.1 - 1 μM范围内调整。
2. 2)推荐探针终浓度为0.1 μM，可根据实验需求在0.05 - 0.25 μM范围内调整。
3. 3)如需要多重RT-qPCR反应，则根据需求进行引物浓度和模板浓度优化。

 

(2)反应程序

推荐一（标准程序）

温度	时间	循环数	目的
50 ℃a	15 min	1	逆转录
95 ℃b	20 sec	1	预变性
95 ℃b	10 sec	}  45 cycles	变性
60 ℃	60 sec		退火/延伸

 

推荐二（快速程序）

温度	时间	循环数	目的
50 ℃a	5 min	1	逆转录
95 ℃b	20 sec	1	预变性
95 ℃b	5-10 sec	}  45 cycles	变性
60 ℃	20-30 sec		退火/延伸

a.如模板结构比较复杂，如GC含量较高，可将逆转录温度提高到55 ℃，有助于提高扩增效率和灵敏度。

b.如模板结构比较复杂，可适当增加预变性和变性时间

 

注意：不同PCR仪器反应条件略有不同，首次使用时请进行条件优化和确认。