M-MuLV反转录酶(RNase H-)
M-MuLV Reverse Transcriptase(RNase H-)
M-MuLV反转录酶(RNase H-)
Cat.No.:ZP04
来源:基因工程生产,大肠杆菌表达
储存温度:-25 ~ -15 ℃保存
有效期:2年
1.产品描述
莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)反转录酶是一种RNA介导的DNA聚合酶。该酶能以 RNA或单链DNA为模板由引物起始合成一条互补的DNA链。雅心Reverse Transcriptase由克隆有M-MuLV Reverse Transcriptase编码基因的重组大肠杆菌生产,通过基因重组技术使RNase H活性缺失,延伸能力增强,热稳定性提高,可耐受50 ℃的反应温度。
适用于动植物和微生物RNA逆转录反应、cDNA文库的构建以及RT-PCR等反应。
2.产品组分
组分 |
MRT01-01(4000 U) |
MRT01-02(10000 U) |
5×RT Buffer |
100 μl |
300 μl |
Reverse Transcriptase(200 U/μL) |
20 μl |
50 μl |
3.活性定义
1单位(U)指以 poly(rA)为模板、oligo(dT)为引物,在37℃条件下,10分钟内催化1 nmol的dTTP掺入形成酸不溶物所需要的酶量。
4.质量控制
- ►无核酸内切酶和核酸外切酶活性,无RNase活性。
5.注意事项
- ►避免RNase污染:保持实验区域洁净;操作时穿戴干净的手套、口罩;所用试剂和耗材均需保证RNase free。
- ►在冰上配制反应液防止RNA降解。
6.常规第一链cDNA合成反应(举例)
(1)RNA模板变性:有助于打开二级结构,可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。
组分 |
体积 |
RNase free ddH2O |
To 13 μl |
Oligo(dT)18(50 μM) |
1 μl |
or Random Primers(50 μM) |
1 μl |
or Gene Specific Primers(2 μM) |
1 μl |
total RNA |
10 pg - 5 μg |
or poly A+ RNA |
10 pg - 0.5 μg |
65 ℃加热5min,立即置于冰水浴骤冷2 min,瞬时离心后加入下表反应体系。
(2)逆转录反应体系配制:注意轻柔吹打混匀
组分 |
体积 |
上一步混合液 |
13 μl |
5×RT Buffer |
4 μl |
dNTP Mixture(各10 mM) |
1 μl |
Reverse Transcriptase(200 U/μl) |
1 μl |
RNase inhibitor(40 U/μl) |
1 μl |
(3)程序设置
温度 |
时间 |
25 ℃ |
5 min |
42 ℃ |
30-60 min |
85 ℃ |
5 min |
注意:
1)使用Random Primers 时,需25 ℃孵育 5 min;使用 Oligo (dT)18 或 Gene Specific Primers,此步可省略。
2)逆转录温度:推荐使用 42 ℃。对于高 GC 含量模板或者复杂二级结构的模板,可将逆转录温度提高至50 ℃。
3)85 ℃加热5 min,目的是使逆转录酶失活。
4)产物可立即用于后续反应,或-20 ℃短期保存,若需长期保存,建议分装后于-80 ℃保存,避免反复冻融。