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重组羧肽酶B

重组Kex2蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒 使用说明书 (96T)K04-Re

重组Kex2蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒

使用说明书

96T)

使用前请仔细阅读说明书和提示部分。若有任何问题,请联系我们。

              

1.试剂盒用途

该试剂盒用于体外定量检测酵母菌液体中重组Kex2蛋白酶含量。本试剂盒仅供研究或工业生产使用。

 

2.试剂盒基本参数

灵敏度 0.108ng/ml

检测范围:0.12-1000 ng/ml

特异性:可检测重组Kex2蛋白酶,与其它重组酵母菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。

重复性:板内,板间变异系数均 < 10%

工作时间:熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。

有效期:6个月

 

3.试剂盒检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测样品中重组Kex2蛋白酶含量。以抗重组Kex2蛋白酶单克隆抗体包被酶标板,样品或标准品中的重组Kex2蛋白与包被抗体结合,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗重组Kex2蛋白酶的另一鼠单克隆抗体与上述抗原-抗体复合物结合,以TMB为显色体系,在450 nm波长参考波长650nm处测OD450/650 nm值,重组Kex2蛋白酶浓度与 OD450/650 nm 值之间呈正比,通过绘制标准曲线计算出样品中重组Kex2蛋白酶的浓度。

 

4.试剂盒组成及保存

客户收到试剂盒后应立即按照下表中的条件分别保存各组分。

将酶标板标记抗体(A2)和TMB底物(A3)置于-20℃保存

 

中文名称

规格

保存条件

冻干标准品 (A1)

100ng/支×4

2-8

标准品 & 样品 &HRP-抗体稀释液25 X(P1)

1瓶×5 ml

2-8

浓缩洗涤液(25 X(P2)

1瓶×40 ml

2-8

底物稀释液(TMB(P3) 

1瓶×15 ml

2-8℃避光

反应终止液 (P4)

1瓶×5 ml

2-8

抗体包被的ELISA酶标板(96孔,可拆卸)

8孔×12

-20

浓缩辣根过氧化物酶化抗体 (A2)

1支×0.05 ml

-20

显色底物(TMB(A3)

5支×0.125 ml

-20℃避光

封板覆膜(可重复使用)

5

 

产品说明书

1

 

质检报告

1

 

 

说明:

1、所有试剂瓶须旋紧瓶盖以防止蒸发和微生物污染。

2、酶标板开封后未使用的剩余板条应封紧密封袋至于-20℃保存

3、运输条件说明:经本实验室实测(非温度加速试验),试剂盒组分在 2-8 度条件下存放 7 天内,试剂盒性能无影响。

 

5.试验所需自备物品

1. 酶标仪(滤光片波长450 nm,参考波长650nm

2. 高精度移液器,EP及一次性吸头、一次性加样槽

3. 37℃恒温箱,双蒸水或去离子水

4. 洁净无纸屑的吸水纸或干布

 

6.待测样品注意事项

1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或 -80℃(3个月内检测),避免反复冻融。

2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围,如果样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释后再测。

3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液,由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

 

7.检测前准备工作

HRP 标记抗体及酶标板板条应始终置于-20℃保存,无需室温平衡, 随用随取。

请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒平衡至室温,观察溶液是否有结晶,如果有结晶按提示进行操作。提前15分钟打开酶标仪预热。

②稀释液配制

浓缩标准品&样品稀释液&HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释(125)。

③洗涤液配制

浓缩洗涤液用双蒸水稀释(125)。

提示:从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超过50℃,使用时洗涤液温度应为室温)。请当日使用。

④标准品配制

将标准品于1000转/分离心1分钟后,加入标准品&样品稀释液1.0 ml至冻干标准品中,旋紧管盖,静置10分钟后上温和颠倒数次,待其充分溶解后,用移液器将其轻轻混匀(浓度为100 ng/ml, 然后进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。使用者可以根据实验需要稀释所需的浓度梯度配置。建议配制成以下浓度: 100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56 ng/ml标准品&样品稀释液直接作为空白孔0 ng/ml

提示溶解和稀释标准品过程中尽量避免产生气泡。

倍比稀释方法

7EP管,每管中加入500 μl标准品&样品稀释液,从100 ng/ml的标准品工作液中吸取500 μl加入含有500 μl样品稀释液的EP管中混匀配成50 ng/ml的标准品工作液,按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。

标准品稀释图例(以500 μl为例

提示:最后一管直接作为空白孔,不再加入标准品工作液。

 

HRP标记抗体工作液配制 

HRP标记抗体应始终置于-20℃保存,请勿室温平衡,随用随取。实验前请先将抗体管低速离心,以避免管壁及管盖上残留抗体。计算实验所需抗体用量(以100 μl /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μl工作液。使用前15分钟,抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度抗体:稀释液 = 1250现配现用

⑥显色底物(TMB)工作液配制

计算实验所需显色底物用量(以100 μl /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μl显色底物工作液。使用前15分钟,用底物稀释液TMB显色底物稀释为工作浓度(底物:稀释液 =120),避光保存,现配现用。

提示:底物加入显色缓冲液混匀后,若观察显色液变蓝切勿加样,说明可能有污染,请更换洁净器皿。

 

8. 洗涤方法

①自动洗板机:每孔加入洗涤液350 μl 注入和吸出间隔3分钟。

②手工洗板:甩尽孔内液体,在洁净厚吸水纸(或干布)上拍干,每孔加入洗涤液350 μl(此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗),浸泡3分钟,吸去(不可触及板壁)或甩掉板内液体,在洁净厚吸水纸上拍干。

提示:推荐使用洗瓶冲洗。若使用排枪,加样槽请不要与其他试剂混用,避免污染。

 

9. 操作步骤

①将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔100 μL。待测样品加入到其他孔,每孔100 μL,若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。

 

提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。浓度由低到高依次加入。

②洗涤:弃去液体,甩干,在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μl,浸泡3分钟,吸去(不可触及板壁)或甩掉板内液体,在洁净厚吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。

③每孔中加入HRP-抗体工作液100 μl,混匀,酶标板覆膜并置于37℃孵育30分钟。

④洗涤:用洗涤液洗板5-7次,每次洗涤3分钟。

⑤每孔加底物显色工作液(TMB100 μl,酶标板覆膜并置于37℃条件下孵育10分钟。

提示:

  1. 推荐使用排枪及加样槽加入显色液及终止液,尽量缩小由于加样时差造成的显色差异。
  2. 根据实际显色情况酌情缩短或延长,显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。

⑥每孔加终止液50 μl,终止反应,室温放置1分钟。

提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头切不要接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。

⑦用酶标仪在450 nm波长(参考波长650nm)测量各孔的光密度(OD450/650 nm值)。

提示: 请提前打开酶标仪电源,预热仪器,设置检测程序。

 

10.结果判断

①计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标(X),OD值为纵坐标(Y),绘出标准曲线(作图时亦可去掉空白组的值)。

②推荐使用专业的曲线制作软件,如curve expert 1.3ELISA Calc(请使用Logistic四参数或五参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线)等,仅供参考。

③若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测。

④典型数据

由于实验操作条件的不同(如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等),标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

 

X-浓度(ng/ml

100

50

25

12.5

6.25

3.125

1.56

0

Y-OD450/650 nm

1.685

1.309

0.882

0.472

0.256

0.148

0.104

0.078

回收量ng/ml

100.5

49.39

25.51

12.15

6.35

3.23

1.59

回收率%

100.5

98.8

102.0

97.2

101.6

103.4

101.9

11.注意事项

1.储存:试剂盒中各种试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶需旋紧以防止蒸发和微生物污染,否则可能会出现错误的结果。

酶标板、标记抗体、TMB底物应始终在-20℃保存,随用随取,无需平衡。

2.酶标板:刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。暂时不用板条应拆下后放入备用自封袋,按推荐温度存放。

3.加样:加样和加同一试剂时,第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间,从而明显的影响到测量值的准确性及重复性,每次的加样时间最好控制在10分钟之内,推荐设置复孔。

4.温育:为防止样品蒸发,实验时必须给酶标板覆膜,洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。

5.洗板:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸或干布上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。读数前要清除酶标板底部残留的液体和手指印,以免影响酶标仪读数。

6.试剂配制:试剂盒在运输过程中会使液体沾到管壁或瓶盖,因此使用1000/分离心一分钟,以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。所有试剂请按说明书指示请精确配制。

7.显色时间的控制:加入底物后,请定时观察反应孔的颜色变化(比如每隔五分钟),如梯度已经很明显,请提前加终止液终止反应,以避免颜色过深,影响酶标仪读数。

8.底物:请避光保存底物。在储存和温育时,避免强光直接照射。

9.混匀:充分轻微混匀对反应结果尤为重要,最好使用微量振荡器,使用最低频率,如无微量振荡器,可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

提示:不同批号的试剂盒组分不能混用(洗涤液和终止液除外)。

10.关于酶标仪波长的选择和计算

本试剂盒测定Kex2蛋白酶残留量推荐使用450nm主波长(650nm参考波长)。主波长与参考波长为酶标仪自身“双波长”设定并测定最终数值,而非单波长450nm测定数值与单波长650nm测定数值做减法计算。如酶标仪无650nm波长,只测定单波长450nm数值亦可满足试剂盒要求。

11.关于样品回收率

1)本试剂盒以测定重组Kex2蛋白酶的抗原性而非活力来推测残留量,因此试剂盒中标准品采用重组Kex2蛋白酶的消光系数(E1%1cm=10.49D, 即当A280nm=1.49时,Kex2蛋白酶浓度为1mg/ml)来计算其蛋白含量,以最大限度保持质控的精确和稳定性。

2)不同计量方法以及产品纯度的差别可以导致不同来源、不同批次产品中抑肽酶的蛋白含量不完全一致,也会造成回收率的差异。

3)为避免上述因素影响,建议将用作回收率测试的样品采用分光光度法(A280nm)估算蛋白含量,再稀释至适合的浓度用于回收率测试,尽量减少回收率的误差。

 

12.问题分析

若实验结果有问题,请及时对显色结果拍照,并妥善保存未使用板条及试剂,然后联系技术支持。也可参考以下信息以找出原因。

 

问题描述

可能原因

相应对策

标准曲线梯度差

吸液或加液不准

检查移液器和吸头

标准品稀释不正确

溶解标准品时稍微旋转瓶身,轻轻混匀使粉末完全溶解

酶标板洗涤不完全

保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量

显色很弱或无色

温育时间太短

保证充足的温育时间

实验温度不正确

使用推荐的实验温度

试剂体积不够或漏加

检查吸液及加液过程,保证所有试剂按顺序足量添加

稀释不正确

读数数值低

酶标仪设置不正确

在酶标仪上检查波长和滤光片装置

提前打开酶标仪预热

变异系数大

加液不正确

检查加液情况

背景值高

检测抗体的工作浓度过高

使用推荐的稀释倍数

酶标板洗涤不完全

重新仔细阅读操作步骤,保证每步清洗完全;如果用自动洗板机,请检查所有的出口是否有堵塞;是否使用试剂盒配备的洗涤液。

洗液有污染

配制新鲜的洗液

灵敏度低

ELISA试剂盒保存不当

按说明书要求保存相关试剂

读数前未终止

OD读数前应在每孔中加入终止液

显色无规律

抗体保存不当

抗体应始终放置于-20℃条件下,随用随取。

 

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