K4-SRT 胰蛋白酶快速酶切试剂盒

试剂盒说明

蛋白质酶切对于蛋白质结构表征、蛋白质鉴定和蛋白质修饰监测至关重要。胰蛋白酶可特异性切割精氨酸和赖氨酸残基的羧基侧肽键，是一种常用于蛋白质消化的酶。胰蛋白酶酶切试剂盒提供了进行蛋白质酶切的必要试剂，可快速进行包括变性，还原，烷基化在内的完整的胰蛋白酶消化。

试剂盒中的胰蛋白酶是雅心自产高纯度和经修饰的测序级重组胰蛋白酶，该酶不具有糜蛋白酶活性，无需TPCK抑制，具有极低程度的自切活性。

试剂盒用途

试剂盒仅供研究和工业使用。不用于药物、诊断或其他用途。

包装规格

包装规格：20～40次检测/盒

注：按标准方法可完成20次或40次反应；根据胰蛋白酶用量调整，实际反应次数可相应变化。

运输条件：冰袋运输

试剂盒组成及储存条件

表1. 试剂盒组件及储存条件

工作程序

检查所需但未提供的材料和设备

高精度移液器，EP管及一次性吸头。

LC-MS相关设备，离心机，水浴锅等。

超纯水（18.2Ω）、LC-MS级甲酸、乙腈等相关试剂。

准备工作

注意：以下是推荐的溶液配制方式，也可根据实际需要进行调整。

取一瓶盐酸胍（GuHCl），加入4 mL酶切缓冲液，充分溶解，配制成8 M GuHCl溶液，2-8℃储存，有效期6个月。

取一支二硫苏糖醇（DTT），短暂离心使粉末落在管底，加入62.5 μL超纯水，充分溶解，配成1 M DTT溶液，用超纯水溶解后-20℃±5℃储存，有效期1个月。

取一支碘乙酰胺（IAM），短暂离心使粉末落在管底，加入125 μL超纯水，充分溶解，配成1 M IAM溶液，用超纯水溶解后-20℃±5℃储存，有效期1个月。

取一支测序级胰蛋白酶，短暂离心使粉末落在管底，加入100 μL复溶缓冲液，充分溶解，配成1 mg/mL酶液，可分装成小体积储存在-20℃±5℃，避免反复冻融，有效期6个月。

计算需使用的甲酸（FA）体积，用超纯水配制10%甲酸水溶液（v/v）。

C.实验流程图

图1. 实验流程图

实验方法

注意：以下实验方法是已验证优化后的样品变性和酶切方式，也可根据实验需要进行参数调整。确保样品在每个反应步骤中混合均匀。

方法一：

将50 µL配制好的GuHCl溶液加入EP管中，加入2 µL配制好的1M DTT，充分混匀。

加入20 µL蛋白样品（浓度为5 mg/mL），充分混匀，盖上盖子，在56℃下反应30 min。注意：蛋白样品的浓度为5 mg/mL（样品可经过浓缩或稀释到5 mg/mL）。在上述反应液中加入4 µL 1M IAM，充分混匀，盖上盖子，在室温、避光条件下反应30 min。

酶切和终止反应：根据实验需要选择脱盐（3a）或者稀释（3b）的方法置换缓冲液

3a脱盐：使用脱盐柱或浓缩管，将样品脱盐并置换到酶切缓冲液（试剂盒提供100 mM Tris-HCl，pH7.5）中，测定浓度，用酶切缓冲液稀释至0.5 mg/mL。取100 µL已脱盐样品加入EP管中，加入2.5 µL复溶的酶液（使酶及蛋白的质量比为1:20，即E:P=1:20），混匀后37℃孵育1-5 h。反应结束后加入10 µL，10%甲酸水溶液，酸化后终浓度约0.44 mg/mL，12000×g离心后进样分析。

3b稀释：在步骤2反应液中加入124 µL酶切缓冲液，此时GuHCl浓度被稀释至2 M以下，蛋白浓度约为0.5 mg/mL，体积为200 µL。在上述稀释液中直接加入5 µL复溶的酶液（E:P=1:20），混匀后37℃孵育1-5 h。反应结束后加入10 µL，10%甲酸水溶液，酸化后终浓度约0.44 mg/mL，12000×g离心后进样分析。

注意：试剂盒给出的酶切参数为E:P=1:20，37℃，pH7.5，2 h快速酶切反应，可根据需要优化酶切参数E:P、温度、pH、时间、缓冲液等。

方法二：

将200 µL配制好的GuHCl溶液加入EP管中，加入8 µL配制好的1M DTT，充分混匀。

加入200 µL蛋白样品（浓度为3 mg/mL），充分混匀，盖上盖子，在37℃下反应30 min。注意：蛋白样品的浓度为3 mg/mL（样品可经过浓缩或稀释到3 mg/mL）。在上述反应液中加入16 µL 1M IAM，充分混匀，盖上盖子，在室温、避光条件下反应30分钟。

酶切和终止反应：

3a. 脱盐：使用脱盐柱或浓缩管，将样品脱盐并置换到酶切缓冲液（试剂盒提供100 mM Tris-HCl，pH7.5）中，测定浓度，用酶切缓冲液稀释至1 mg/mL。取100 µL已脱盐样品加入EP管中，加入5 µL复溶的酶液（E:P=1:20），混匀后37℃孵育1-5 h。反应结束后加入10 µL，10%甲酸水溶液，酸化后终浓度约0.86 mg/mL，12000×g离心后进样分析。

3b. 稀释：在步骤2反应液中加入450 µL酶切缓冲液，此时GuHCl浓度被稀释至2 M以下，蛋白浓度约为0.68 mg/mL，取100 µL上述稀释液，加入3.5 µL复溶的酶液（E:P=1:20），混匀后37℃孵育1-5 h。反应结束后加入10 µL，10%甲酸水溶液，酸化后终浓度约0.6 mg/mL，12000×g离心后进样分析。

注意：试剂盒给出的酶切参数为E:P=1:20，37℃，pH7.5，5 h快速酶切反应，可根据需要优化酶切参数E:P、温度、pH、时间、缓冲液等。

注意事项

试剂盒组件及储存条件

实验开始前仔细阅读表1试剂盒组成和储存条件，不同样品采用不同的保存方式。

脱盐/稀释

当溶液中胍盐浓度较高时，胰蛋白酶活性会受到抑制。可通过脱盐或稀释的方法，将胍盐浓度降低至2 M浓度以下。

酶切反应

酶切反应参数中，酶及蛋白的质量比（E:P）、温度、pH、酶切时间会影响蛋白样品的酶切程度，如酶切不完全会导致形成较多含赖氨酸或精氨酸的大分子肽，影响序列覆盖度或肽段总丰度。试剂盒推荐的酶切参数为E:P=1:20，37℃，pH7.5，1-5 h快速酶切反应。可根据不同蛋白或实验条件需要对酶切参数进行优化。

问题分析