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重组牛肠激酶酶联免疫吸附测定试剂盒 使用说明书(96T)

 

重组牛肠激酶酶联免疫吸附测定试剂盒

使用说明书(96T)

使用前请仔细阅读说明书。若有任何问题,请联系我们。

              

 

1.试剂盒用途

该试剂盒用于体外定量检测重组牛肠激酶含量。 本试剂盒仅供研究或工业生产用。

 

 

2.试剂盒基本参数

灵敏度 ≤ 1 ng/ml

检测范围:0.25 -16 ng/ml

特异性:可检测重组牛肠激酶,与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。

重复性:板内,板间变异系数均 < 10%。

工作时间:熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。

有效期:6个月

 

 

3.试剂盒组成及保存

未拆封的试剂盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用试剂盒,请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。

中文名称

规格

保存条件

抗体包被的ELISA酶标板(96孔可拆卸)

(MicroELISA Plate(Dismountable)

8孔×12条

-20℃

冻干标准品(16ng/支)(A1)

(Reference Standard)

4支

2-8

浓缩辣根过氧化物酶化抗体 (A2)

(Concentrated HRP-Detection Ab)

1支×0.05mL

-20℃

浓缩标准品 & 样品稀释液 & HRP-抗体稀释液(25 X)(P1)

(Concentrated Reference Standard, Sample&Concentrated HRP Ab Diluents) (25x)

1瓶× 5 mL

2-8

浓缩洗涤液(25 X)(P2)

(Concentrated Wash Buffer) (25x)

1瓶×40 mL

2-8

显色底物(TMB)(A3)

(Substrate Reagent)

5支×0.125 mL

-20℃ 避光

底物稀释液(TMB)(P3)(Substrate diluents)

1瓶×15 mL

2-8℃ 避光

反应终止液 (P4)(Stop Solution)

1瓶×5 mL

2-8

封板覆膜(可重复使用)(Plate Sealer,reuseble)

5张

 

产品说明书(User Manual)

1份

 

质检报告(Certificate of Analysis)

1份

 

 

 

说明: 

1.所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。

2.酶标板-20℃可存放6个月,2-8℃存放勿超过一周。

 

4.试验所需自备物品

1.酶标仪(滤光片波长450 nm和650nm)

2.高精度移液器,EP管及一次性吸头

3. 37℃恒温箱,双蒸水或去离子水

4.吸水纸

 

5.待测样品注意事项

1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或 -80℃(3个月内检测),避免反复冻融。

2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围,如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释后再测。

3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液,由于引入某些化学物质可能会导致ELISA测值出现偏差。

 

6.检测前准备工作

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。提前15分钟打开酶标仪预热。

2.稀释液配制

将浓缩标准品 & 样品稀释液 或 浓缩HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释(1:25)。

3.洗涤液配制

将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。

提示:从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超过50℃,使用时洗涤液温度应为室温)。请当日使用。

4.标准品配制

将标准品于1000转/分离心1分钟,加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中,旋紧管盖,静置10分钟,上下颠倒数次,待其充分溶解后,用移液器将其轻轻混匀(浓度为16ng/ml), 然后进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。建议配制成以下浓度: 16、8、4、2、1、0.5、0.25ng/ml。样品稀释液直接作为空白孔0 ng/ml。

 

倍比稀释方法

取7只EP管,每管中加入500 μL标准品&样品稀释液,从16 ng/ml的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL样品稀释液的EP管中混匀配成8 ng/ml的标准品工作液,按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。

标准品稀释图例(以500 μL为例)

img1

提示:最后一管直接作为空白孔。

 

5.HRP标记抗体工作液配制

实验前请先将抗体管低速离心,以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟,用抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度(抗体:稀释液 = 1:250),当日使用。

 

6.TMB显色工作液配制

实验前计算实验所需用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟,用底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度(底物:稀释液 =1:20),当日使用。

 

7.洗涤方法

1.自动洗板机:每孔加入洗涤液350 μL, 注入和吸出间隔60秒。

2.手工洗板: 甩尽孔内液体,在洁净厚吸水纸(或干布)上拍干,每孔加入洗涤液350 μL(此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗),浸泡2-3分钟,吸去(不可触及板壁)或甩掉板内液体,在洁净厚吸水纸上拍干。

 

8.操作步骤

1.将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔100 μL。待测样品加入到其他孔,每孔100 μL,若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。

提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。

2.洗涤:弃去液体,甩干,在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μL,浸泡3分钟,吸去(不可触及板壁)或甩掉板内液体,在洁净厚吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。

3.每孔中加入HRP-抗体工作液100 μL,混匀,酶标板覆膜并置于37℃孵育30钟。

4.洗涤:用洗涤液洗板4次,方法步骤同2。

5.每孔加底物显色工作液(TMB)100 μL,酶标板覆膜并置于37℃条件下孵育10分钟。

提示: 根据实际显色情况酌情缩短或延长,显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。

6.每孔加终止液50 μL,终止反应,室温放置1分钟。

提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头切不要接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。

7.用酶标仪在450 nm波长(参考波长650nm)测量各孔的光密度(OD450/650 nm值)。

提示: 请提前打开酶标仪电源,预热仪器,设置检测程序。

 

9.结果判断

1.计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标(X),OD值为纵坐标(Y),绘出标准曲线(作图时亦可去掉空白组的值)。

2.推荐使用专业的曲线制作软件(如curve expert 1.3或ELISA Calc等)根据实验具体要求绘制标准曲线。

3.若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测。

4.典型数据

由于实验操作条件的不同(如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等),标准曲线的OD值可能有所差异。本试用试剂盒提供0.25-16 ng/mL范围的数据和曲线供参考,实验者可根据需求在此范围内选点建立标准曲线。

 

1)测定范围0.25-16ng/mL标准曲线

X-浓度(ng/mL)

16

8

4

2

1

0.5

0.25

0

Y-OD450/650nm

1.613

1.350

0.955

0.609

0.342

0.195

0.134

0.069

回收量(ng/mL)

15.89

8.10

3.92

2.04

0.99

0.48

0.26

回收率%

99.3

101.2

98.0

102.0

99.0

96.0

104.0

 

img2img3

 

 

 

10.注意事项

1.储存:试剂盒中各种试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶需旋紧以防止蒸发和微生物污染,否则可能会出现错误的结果。

2.酶标板:刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。暂时不用板条应拆下后放入备用自封袋,按推荐温度存放。

3.加样:加样和加同一试剂时,第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间,从而明显的影响到测量值的准确性及重复性,每次的加样时间最好控制在10分钟之内。推荐设置复孔。

4.温育:为防止样品蒸发,实验时必须给酶标板覆膜,洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。

5.洗涤:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。在读数前要清除酶标板底部残留的液体和手指印,以免影响酶标仪读数。

6.试剂配制:试剂盒在运输过程中会使液体沾到管壁或瓶盖,因此使用1000转/分离心一分钟,以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前请用移液器小心吹打4-5次,使溶液混匀。所有试剂请按说明书指示请精确配制。

7.显色时间的控制:加入底物后,请定时观察反应孔的颜色变化(比如每隔五分钟),如梯度已经很明显,请提前加终止液终止反应,以避免颜色过深,影响酶标仪读数。

8.底物:请避光保存底物。在储存和温育时,避免强光直接照射。

9.混匀:充分轻微混匀对反应结果尤为重要,最好使用微量振荡器,使用最低频率,如无微量振荡器,可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

10.不同批号的试剂盒组分不能混用(洗涤液和终止液除外)。

11.关于样品回收率

1)本试剂盒以测定重组牛肠激酶的抗原性而非活力来推测蛋白残留量,因此试剂盒中标准品采用重组牛肠激酶的消光系数(E1%1cm=20.01D, 即当A280nm=2.01时,牛肠激酶浓度为1mg/ml)来计算其蛋白含量,并采用内部质控以最大限度保持标准品含量的精确和恒定。

2)不同计量方法以及产品纯度的差别可以导致不同来源、不同批次产品中牛肠激酶的蛋白含量不完全一致,也会造成回收率的差异。为避免上述因素影响,建议将用作回收率测试的样品采用分光光度法(A280nm)估算蛋白含量,再稀释至适合的浓度用于回收率测试,尽量减少回收率的误差。

 

11.问题分析

若实验结果有问题,请及时对显色结果拍照,并妥善保存未使用板条及试剂,然后联系技术支持。也可参考以下信息找出原因。

 

 

 

问题描述

可能原因

相应对策

 

标准曲线梯度差

吸液或加液不准

检查移液器和吸头

标准品稀释不正确

溶解标准品时稍微旋转瓶身,轻轻混匀使粉末完全溶解

洗涤不完全

保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量

 

 

 

显色很弱或无色

温育时间太短

保证充足的温育时间

实验温度不正确

使用推荐的实验温度

试剂体积不够或漏加

检查吸液及加液过程,保证所有试剂按顺序足量添加

稀释不正确

 

读数数值低

 

 

酶标仪设置不正确

 

在酶标仪上检查波长和滤光片装置

提前打开酶标仪预热

变异系数大

加液不正确

检查加液情况

 

 

 

背景值高

 

检测抗体的工作浓度过高

使用推荐的稀释倍数

 

酶标板洗涤不完全

重新仔细阅读操作步骤,保证每步清洗完全;如果用自动洗板机,请检查所有的出口是否有堵塞;是否使用试剂盒配备的洗涤液。

洗液有污染

配制新鲜的洗液

 

灵敏度低

ELZSA试剂盒保存不当

按说明书要求保存相关试剂

读数前未终止

OD读数前应在每孔中加入终止液

 

 

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    一套
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