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重组羧肽酶B

重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒 使用说明书 (96T)K02-RPT

使用前请仔细阅读说明书和提示部分。若有任何问题,请联系我们。

 

 

1.试剂盒用途

本试剂盒用于体外定量检测待测样品中重组胰蛋白酶含量。本试剂盒仅供研究和工业生产使用。

 

2.试剂盒基本参数

灵敏度:≤ 1 ng/ml

检测范围:0.078 - 40 ng/ml

特异性:可检测重组胰蛋白酶,与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。

重复性:板内,板间变异系数均 < 10%

工作时间:熟练实验人员可在 2.5 小时内完成一次测定。

有效期:6 个月

 

3.试剂盒组成及保存

未拆封的试剂盒可在 2-8℃保存一周。如果一周以后才使用试剂盒,请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。

 

中文名称

规格

保存条件

冻干标准品 (A1)

Reference Standard

10ng/支×4

2-8

浓缩标准品&样品稀释液& HRP-抗体稀释液(25 X(P1)

Concentrated Reference Standard & Sample Diluent &

Concentrated HRP- Ab Diluent (25x)

1 瓶×5 mL

2-8

浓缩洗涤液(25 X(P2)

Concentrated Wash Buffer (25x)

1 瓶×40 mL

2-8

底物稀释液(TMB(P3)

Substrate Reagent

1 瓶×15 mL

2-8℃避光

反应终止液 (P4)

Stop Solution

1 瓶×5 mL

2-8

抗体包被的 ELISA 酶标板(96 孔,可拆卸)

MicroELISA Plate(Dismountable)

8 孔×12

-20

浓缩辣根过氧化物酶化抗体 (A2)

Concentrated HRP-Detection Ab

1 支×0.05mL

-20

显色底物(TMB(A3) Substrate Reagent

5 支×0.125 mL

-20℃避光

封板覆膜(可重复使用)(Plate Sealer

5

/

产品说明书 (User Manual

1

/

质检报告 (Certificate of Analysis

1

/

说明:

①所有试剂瓶须旋紧瓶盖以防止蒸发和微生物污染。

②酶标板-20℃可存放 6 个月,2-8℃存放勿超过一周。

 

4.试验所需自备物品

  • 酶标仪(滤光片波长 450 nm 650nm
  • 高精度移液器,EP 管及一次性吸头,加样槽
  • 37℃恒温箱,双蒸水或去离子水
  • 洁净无纸屑的吸水纸或干布
  •  

5.待测样品注意事项

①样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于 2-8℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1 个月内检测),或 -80℃(3 个月内检测),避免反复冻融。

②试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围,如果样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释后再测。

.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液,由于引入某些化学物质会导致 ELISA 测值出现偏差。

 

6.检测前准备工作

①请提前 20 分钟从冰箱中取出试剂盒平衡至室温,观察溶液是否有结晶,如果有结晶按提示进行操作。提前 15 分钟打开酶标仪预热。

②稀释液配制

将浓缩标准品&样品稀释液&HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释(125)。

③洗涤液配制

将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(125)。

提示:从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用 40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超过 50℃,使用时洗涤液温度应为室温)。请当日使用。

④标准品配制

将标准品于1000/分离心1分钟后,加入标准品&样品稀释液 1.0 mL 至冻干标准品中,旋紧管盖,静置 10 分钟后上下颠倒数次,待其充分溶解后,用移液器将其轻轻混匀(浓度为 10 ng/mL, 然后进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。建议配制成以下浓度:1052.51.250.630.3120.1560 ng/mL。标准品&样品稀释液直接作为空白孔 0 ng/mL

提示:溶解和稀释标准品过程中尽量避免产生气泡。

倍比稀释方法

7 EP 管,每管加入 500 μL标准品&样品稀释液,从 10 ng/mL 的标准品工作液中吸取 500 μL加入含有 500 μL标准品&样品稀释液的 EP 管中混匀配成 5 ng/mL 的标准品工作液,按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。

标准品稀释图例(以500 μL为例)

提示:最后一管直接作为空白孔,不再加入标准品工作液。

HRP-抗体工作液配制实验前请先将抗体管1000/分离心1分钟,以避免管壁及管盖上残留抗体。计算实验所需抗体用量(以 100 μL /孔计算),实际配制时应多配制 100-200 μL工作液。使用前 15 分钟,用 HRP-抗体稀释液将浓缩辣根过氧化物酶化抗体稀释为工作浓度(抗体:稀释液 = 1

250),当日使用。

⑥显色底物(TMB)工作液配制

计算实验所需显色底物用量(以 100 μL /孔计算),实际配制时应多配制 100-200 μL显色底物工作液。使用前 15 分钟,用底物稀释液将 TMB 显色底物稀释为工作浓度(底物:稀释液

=120),避光保存,当日使用。

提示:配制显色底物(TMB)工作液要严格避免污染,如出现变蓝的现象应重新配制。

 

7.洗板方法

①自动洗板机:每孔加入洗涤液 350-400 μL(根据加满孔的标准进行调整),注入和吸出间隔 60 秒。

②手工洗板:甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干,每孔加入洗涤液 350-400 μL(根据加满孔的标准进行调整),浸泡 2-3 分钟,甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸上拍干。

 

8.操作步骤

①将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔(复孔),每孔 100 μL。待测样品加入到其他孔,每孔 100 μL,若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于 37℃孵育 60 分钟。

提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡。

加样时间控制在10分钟内。

②洗涤:甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。每孔加入 350-400 μL(根据加满孔的标准进行调整)洗涤液,浸泡 2-3 分钟,甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。重复此洗板步骤3次。

③每孔加入 HRP-抗体工作液 100 μL,轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡,将酶标板覆膜并置于 37℃孵育 30 分钟。

④洗涤:用洗涤液洗板 4 次,方法同步骤 2

提示:酶标板洗涤不完全可能会造成标准曲线梯度差,或背景值高。应注意加入洗涤液的体积,以加满酶标板的孔为标准进行调整,确保所有的孔浸泡在洗涤液中并浸泡 2-3 分钟。

⑤显色:每孔加显色底物(TMB)工作液 100 μL,酶标板覆膜置于 37℃ 孵育 10 分钟。提示: 加显色底物推荐使用排枪和加样槽,但应严格避免底物污染,确保所使用的加样槽洁净或一次性使用,加液时移液枪的枪头切不要接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。可通过观察加样槽中底物是否变蓝预判底物是否被污染。根据实际显色情况酌情缩短或延长,显色时间在 5-30 分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。

⑥终止:每孔加终止液 50 μL,终止反应,室温放置 1 分钟。推荐使用排枪和加样槽。

提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪的枪头切不要接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。

⑦读数:用酶标仪在 450 nm 波长(参考波长 650nm)测量各孔的光密度(OD450/650 nm 值)。

提示: 请提前 15 分钟打开酶标仪电源,预热仪器,设置检测程序。

 

9.结果判断

①计算每组复孔的平均 OD 值。每个标准品的平均 OD 值减去空白孔的 OD 值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标(X),OD 值为纵坐标(Y),绘出标准曲线(作图时亦可去掉空白组的值)。

②推荐使用专业的曲线制作软件,如 curve expert 1.3 ELISA Calc(请使用 Logistic 五参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线)等。

③若样品 OD 值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测。

④典型数据由于实验操作条件的不同(如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等),标准曲线的

OD 值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

X- 浓 度

ng/mL

10

5

2.5

1.25

0.625

0.31

2

0.156

0

Y-OD450/650 nm

1.601

1.45

4

1.23

1

0.87

2

0.624

0.38

2

0.244

0.057

Y-OD450/650 nm

(去本底)

1.574

1.39

7

1.17

4

0.81

5

0.567

0.32

5

0.187

0

回收量

ng/mL

10.16

7

4.82

2

2.62

8

1.18

2

0.657

0.30

6

0.153

回收率%

101.7

96.4

105.

1

94.6

105.1

98.1

98.1

 

10.注意事项

①储存:试剂盒中各种试剂请按说明书提示合理存放。储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶需旋紧以防止蒸发和微生物污染,否则可能会出现错误结果。

②酶标板:刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。暂时不用板条应拆下后放入备用自封袋,按推荐温度存放。

③加样:加样和加同一试剂时,第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间,从而明显的影响到测量值的准确性及重复性,每次的加样时间最好控制在 10 分钟之内,推荐设置复孔。

④温育:为防止样品蒸发,实验时必须给酶标板覆膜,洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。

⑤洗板:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸或干布上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。读数前要清除酶标板底部残留的液体和手指印,以免影响酶标仪读数。

⑥试剂配制:试剂盒在运输过程中会使液体沾到管壁或瓶盖,因此使用 1000 /分离心一分钟,以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前请用移液器小心吹打 4-5 次使溶液混匀。

所有试剂请按说明书指示请精确配制。

⑦显色时间的控制:加入底物后,请定时观察反应孔的颜色变化(比如每隔五分钟),如梯度已经很明显,请提前加终止液终止反应,以避免颜色过深,影响酶标仪读数。

⑧底物:请避光保存底物。在储存和温育时,避免强光直接照射。

⑨混匀:充分轻微混匀对反应结果尤为重要,最好使用微量振荡器,使用最低频率,如无微量振荡器,可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。

提示:不同批号的试剂盒组分不能混用(洗涤液和终止液除外)。

⑩关于样品回收率

  1. 本试剂盒以测定重组猪胰蛋白酶的抗原性而非活力来推测残留量,因此试剂盒中标准品

采用胰蛋白酶的消光系数(E1%1cm=13.6D, 即当 A280nm=1.36 时,胰蛋白酶浓度为 1mg/ml)来计算其蛋白含量,以最大限度保持质控的精确和稳定性。

  1. 不同计量方法以及产品纯度的差别可以导致不同来源、不同批次产品中胰蛋白酶的蛋白含量不完全一致,也会造成回收率的差异。
  2. 为避免上述因素影响,建议将用作回收率测试的样品采用分光光度法(A280nm)估算蛋白含量,再稀释至适合的浓度用于回收率测试,尽量减少回收率的误差。
  3.  

11.问题分析

若实验结果有问题,请及时对显色结果拍照,并妥善保存未使用板条及试剂,然后联系技术支持。也可参考以下信息以找出原因。

 

问题描述

可能原因

相应对策

标准曲线梯度差

吸液或加液不准

检查移液器和吸头

标准品稀释不正确

溶解标准品时稍微旋转瓶身,轻轻混匀使粉末完全溶解

酶标板洗涤不完全

保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量

显色很弱或无色

温育时间太短

保证充足的温育时间

实验温度不正确

使用推荐的实验温度

试剂体积不够或漏加

检查吸液及加液过程,保证所有试剂按顺序足量添加

稀释不正确

读数数值低

酶标仪设置不正确

在酶标仪上检查波长和滤光片装置

提前打开酶标仪预热

变异系数大

加液不正确

检查加液情况

背景值高

检测抗体的工作浓度过高

使用推荐的稀释倍数

酶标板洗涤不完全

重新仔细阅读操作步骤,保证每步清洗完全;如果用自动洗板机,请检查所有的出口是否有堵塞;是否使用试剂盒配备的洗涤液。

洗液有污染

配制新鲜的洗液

灵敏度低

ELZSA试剂盒保存不当

按说明书要求保存相关试剂

读数前未终止

OD读数前应在每孔中加入终止液

 

 

 
 

 

  • 产品规格
    一套
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