K-CSI01 细胞种属鉴别检测试剂盒（多重PCR法）

试剂盒简介

细胞种属鉴别是生物制品生产用细胞基质质量控制要求之一，也是保障生物制品生产使用正确细胞基质、防止细胞误用或交叉污染的重要措施。雅心细胞种属鉴别检测试剂盒（多重PCR法）可用于对细胞基质的物种来源进行鉴定，以确认细胞系身份以及是否存在其他细胞系的污染。本试剂盒基于多重PCR法和电泳技术，通过扩增动物细胞线粒体细胞色素b、细胞色素氧化酶Ⅰ（COX Ⅰ）或细胞色素氧化酶Ⅱ（COX Ⅱ）基因，根据PCR扩增子的大小鉴别细胞种属来源和污染情况。本法适用于猪、人、猫、中国仓鼠、恒河猴、非洲绿猴、大鼠、犬、小鼠和牛的细胞种属鉴别。如已知供试品的细胞种属信息且在多重PCR法可检测的种属范围内，可选择多重PCR法进行鉴别并判定是否存在其他种属来源细胞的交叉污染。

试剂盒组分

规格：25 Reactions、50 Reactions

表1  试剂盒组分

【注】：DNA Marker融化后于2-8℃保存，避免反复冻融。

有效期

规定储存条件下2年，具体详见试剂盒标签。

适用机型（包括但不限于）

经适用性验证的PCR扩增仪（包含定量PCR仪）

所需器材

仪器：移液器、漩涡混匀仪、瞬时离心机、高速离心机、PCR仪、恒温金属浴或恒温水浴锅、核酸电泳和成像相关设备

材料：1.5 mL无菌低吸附离心管、PCR管或八联管、低吸附带滤芯移液吸头、PBS（无菌）等

核酸电泳配套试剂：琼脂糖、核酸染料、TBE

操作过程

实验前请仔细完整阅读本说明书

• 细胞基因组DNA提取液制备

1. 样本前处理

收集新鲜培养的待测细胞（总数为1×10⁵ - 1×10⁶）于1.5 mL离心管中，1000 rpm离心5 min尽可能弃掉培养基，在细胞沉淀中加500 μL PBS溶液轻微震荡重悬细胞。12000 rpm离心2 min，尽可能弃净上清。

【注】：建议此步骤结束后立即进行下一步检测；如果不能立即检测则将细胞沉淀置于可置-70℃及以下保存不超过6个月。

2. 细胞裂解&基因组DNA提取

在每管待测样品中加入100 μL Cell Extraction Buffer，再加入2 μL的Proteinase K（20 mg/mL），立即漩涡震荡混匀。瞬时离心3-5 sec后，置于60℃金属浴中处理30 min，之后95℃处理5 min，即制备供试品基因组DNA提取液。冷却至室温后，12000 rpm离心2 min取上清作为后续PCR扩增的模板。

【注】：供试品基因组DNA提取液，置-20℃及以下保存，保存时间不超过1个月，避免反复冻融，如需多次使用，可分装保存。

3. 阴性质控NCS制备

取无细胞的空白离心管，按照步骤2与待测样品同时进行操作。

• 多重PCR反应液配制与加样

1. 多重PCR反应液制备（阴性区域）

2.1 根据所要检测的样品数量，计算所需反应孔数。

反应孔数=1个无模板对照NTC + 1个阴性质控NCS + 1个阳性质控（Positive Templates Mix）+ 待测样品数

2.2 根据反应孔数（增加1孔的损失量），将除模板外的组分混合成Mix反应液，各试剂置于冰上或低温下融化，轻微振荡混匀，瞬时离心3-5 sec，重复2-3次确保充分混匀，加样。

Mix反应液=（反应孔数+1）×12.5 μL 2X Multiplex PCR Buffer +（反应孔数+1）× 4.5 μL Primers Mix（含有1孔的损失量，如检测样本较多，可适当增加）

表2  Mix反应液配制表

2.3 将Mix反应液充分混匀后按照17 μL/管分装至8联管或PCR管中。

2. 阳性质控品工作液制备（阳性区域）

将试剂盒中的Nuclease-free Water和Positive Templates Mix置于低温或室温下融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，瞬时离心3-5 sec，重复2-3次确保充分混匀。取18 μL Nuclease-free Water于一个新的1.5 mL离心管中，加入2 μL Positive Templates Mix，充分混匀后配成Positive Templates Mix工作液备用。

【注】：初次使用时建议将Positive Templates Mix分装储存，减少反复冻融次数和避免污染。

3. 加样（阴性区域和阳性区域）

按照表3在相应管中加入8 μL样品。加完样品后每管体积为25 μL。

表3  各反应孔加样示例

【注】：（1）Positive Templates Mix工作液是Positive Templates Mix用Nuclease-free Water稀释10倍所得。

（2）加样完成后密封好管子，低速离心后混匀再低速离心，完全混匀反应液，如有气泡，需将气泡排尽。

• 多重PCR反应

在PCR仪器上按照表4进行扩增程序设置。

表4  多重PCR反应程序

• 琼脂糖凝胶电泳（电泳间）

1. 制胶

检测所用的琼脂糖凝胶比例为2.5%，制胶所用托盘长度需≥60 mm。

2.5%凝胶（w/v）=（琼脂糖g/ 1 × TBE缓冲液mL）× 100% + 适量核酸染料

【注】：TBE的工作浓度为1×，配制工作液前请仔细观察母液是否有沉淀析出，如有析出请水浴加热（37℃）至沉淀完全溶解；如用粉末进行配制，则需确保粉末完全溶解。

2. 点样

将8联管或PCR管瞬时离心后小心开盖。电泳上样量推荐6-10 μL，同时使用5 μL DNA Marker作为标记。

【注】：点样时请小心，避免戳破胶孔或溢出至其他孔道。

3. 电泳

电泳液为1 × TBE缓冲液，100-150 V恒压电泳，至溴酚蓝至凝胶（凝胶长度约60 mm）边缘处停止电泳（时间约50 min至1.5 h）。使用凝胶成像仪分析电泳结果。

• 电泳结果判定

1. 实验有效性判定
   1. 无模板对照NTC和阴性质控NCS应无扩增条带。
   2. 阳性质控10条扩增条带清晰可见，且条带大小应与图1泳道11分布一致。对应条带大小分别为猪464 bp、人394 bp、猫355 bp、中国仓鼠315 bp、恒河猴287 bp、非洲绿猴256 bp、大鼠200 bp、犬172 bp、小鼠147 bp、牛93 bp。

图1  细胞种属鉴别检测PCR产物电泳图

2. 供试品结果判定
   1. 若待测样品的扩增子只有一个条带，且条带大小与目标细胞种属的扩增子条带大小一致，则可判定待测样品的细胞种属，且表明该样品无污染。
   2. 若待测样品的扩增子含有两个及以上条带，且条带大小与阳性质控品条带位置对应，则表明待测样品中含有其他种属细胞污染。与阳性质控的电泳条带进行对比，以判定污染的细胞种属。
   3. 为了结果的可靠性，建议对待检样品进行两次独立重复测试。