重组肠激酶如何溶解,酶切条件如何?

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1)使用pH和缓冲液体系是什么?

pH=8,缓冲液体系为25mM Tris-HCl

 

2)融合蛋白的使用量?

融合蛋白浓度0.1-1mg/ml(蛋白总量50-100µg),使用量为0.1-0.2U。每1U可酶切500µg融合蛋白。

 

3)酶切温度和酶切时间?

酶切温度为25℃,过夜酶切,或完全酶切需12h-16h

 

4)咪唑存在是否影响酶切?

咪唑含量在100mM以下,NaCl浓度在50mM以下,甘油浓度小于5%以下进行酶切,酶的用量与蛋白的比例不变(即1U酶切500µg蛋白)。

 

5)影响酶切的条件有哪些?如何解决?

在>200mM 咪唑,或>200mMNaCl,或>5%甘油,酶切效果受影响。可参照以下推荐方法进行酶切:

1)为获得理想酶切结果,请将样品透析到25mM Tris-HCl 8.0缓冲液中,再进行酶切。

2)若不便透析,可将样品稀释,咪唑含量在100mM以下,NaCl浓度在50mM以下,甘油浓度小于5%以下进行酶切,酶的用量与蛋白的比例不变(即1U酶切500µg蛋白)。

3)如果样品溶液中含有上述成分中的一种或多种,且不便去除,此时适当增加酶量或延长酶切时间,也可达到较好酶切效果。

 

 

 

  

2019年11月5日 11:17
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