胰蛋白酶细胞消化液的活性测定和抑肽酶对胰蛋白酶的抑制

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一、实验目的

1.测定sigma公司的trypsin-EDTA细胞消化液的活性。

2.用重组抑肽酶抑制trypsin-EDTA细胞消化液中trypsin活性达完全所需的抑肽酶的量。

 

二、实验材料

1) Trypsin-EDTA solution , sigma T4049-100ml  Lot # SLBN6048V  EXP Aug 17, 0.25%, sterile filtered,BioReagent, suitable for cell culture, 2.5g porcine trypsin and 0.2g EDTA per liter ofHank’s Balanced Salt Solution with phenol red.

2) RTI (recombinant aprotinin) Lot # 160301 ,  5.8 EPU/mg, 21.9mg/ml

3) 活性测定底物:BAEE溶液,按照公司标准方法配置。

4) 胰蛋白酶活性测定方法,按照公司标准方法操作。

 

三、实验过程及结果

1) 测定trypsin-EDTA solution的活性:4150 BAEE unit/ml,

2) 按照1EPU RTI可抑制16200 BAEE unit的胰蛋白酶活性,

计算完全抑制4150 BAEE unit/ml胰蛋白酶的RTI用量为 4150/16200=0.256 EPU

 

四、具体实验如下

2.1. 150ul trypsin-EDTA solution,总活性为622.5 BAEE unit (4150 BAEE unit/ml * 0.15)

2.2. 计算完全抑制,所需加入RTI的体积,622.5/16200=0.0384 EPU,换算为体积为:0.0384/(5.8*21.9)=0.302ul,将RTI稀释10倍后,加入量为3.02 ul

反应5min后,测定胰蛋白酶活性。

无活性。

结论:完全抑制

2.3. 计算50%抑制所需的加入量为1.51ul 其他操作同2.2

反应5min后,测定胰蛋白酶活性。

测定活性:2100BAEE unit/ml

结论:抑制率为49.39%

 

五、结论

11EPU RTI可完全抑制16200 BAEE unit的胰蛋白酶活性,若不完全抑制,则抑制率与加入的RTI的量成正比。

2)按照胰蛋白酶活性加入RTI (aprotinin)的量。

3Trypsin-EDTA solution , sigma T4049-100ml  Lot # SLBN6048V的活性为4150 BAEE/ml

若达到完全抑制,每ml中加入aprotinin的量为0.256 EPU

加入一半量的aprotinin,可抑制一半的胰蛋白酶活性。

 

 

 

  

2019年11月5日 11:17
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