K3-RS01 T7高产量RNA合成试剂盒
一.试剂盒简介
RNA聚合酶通常用于合成大量RNA，是整个体外转录反应的灵魂，从根源上决定着体外转录（in vitro transcription, IVT）合成产物中mRNA质量的优劣。T7 RNA聚合酶具有转录率高、特异性强、保真度高等优势，是目前最为常用的启动子之一。本试剂盒是专为使用T7 RNA聚合酶体外转录RNA而设计的，搭配优化的体外转录体系，操作简单便捷，可实现高产量RNA转录物的合成和修饰核苷酸的掺入，以获得高特异性的放射性标记RNA探针和加帽、生物素标记和染料标记的RNA。
本试剂盒每个标准反应（20 μL体系，1 μg模板）可以转录生成150-200 μg的RNA，转录合成的RNA适用于多方面的下游应用，如RNA结构和功能研究、反应RNA和RNAi实验、RNA酶保护、核酶生物化学、探针杂交和mRNA疫苗等。
二.试剂盒组分
试剂盒规格：50 Reactions
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组分编号 |
组分名称 |
组分规格 |
储存条件 |
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RS01-A |
Nuclease-free Water |
1 mL |
-20 ℃ |
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RS01-B |
10X Reaction Buffer |
100 μL |
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RS01-C |
ATP (100 mM) |
100 μL |
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RS01-D |
UTP (100 mM) |
100 μL |
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RS01-E |
GTP (100 mM) |
100 μL |
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RS01-F |
CTP (100 mM) |
100 μL |
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RS01-G |
T7 Enzyme Mix |
100 μL |
三.运输和储存
干冰运输。规定储存条件下2年有效，具体详见试剂盒标签。
四.操作流程
1.DNA模板制备
带有T7启动子的PCR产物、线性化的质粒DNA或合成的DNA片段都可以用作T7 High Yield RNA Synthesis Kit体外转录的模板。模板可用TE缓冲液或Nuclease-free Water溶解。图1显示了T7启动子序列、转录起始位点和T7转录后的RNA转录物。
图1 T7 RNA聚合酶介导转录
Figure1 Transcription by T7 RNA Polymerase
（1）PCR产物模板
通过PCR扩增获得带有T7启动子的PCR产物可以作为体外转录的模板。带有T7启动子的PCR产物可用通过在有义链的上游引物的5’端加T7启动子序列而获得。PCR产物推荐纯化后再使用，可获得更高的产量。
（2）线性化质粒模板
带有T7启动子的质粒可以作为体外转录的模板。模板DNA的质量影响转录率和合成RNA的完整性，高纯度的完全线性化的质粒模板是体外转录成功的关键。为了产生一定长度的RNA转录物，防止T7 RNA聚合酶转录过头，用作转录模板的质粒必须是线性化的。限制性酶切位点不一定是固定的，建议选择产生平头或5’突出的限制性内切酶。限制性酶切后的产物必须经过纯化，防止蛋白质、盐等污染抑制体外转录反应。
（3）合成的DNA片段模板
合成的DNA寡核苷酸，无论是完全双链还是大部分单链但T7启动子是双链的序列都可以作为本试剂盒的模板，即只要带有双链T7启动子序列的DNA模板都可以进行体外转录。通常，以合成DNA片段作为模板的产率较低，并且与合成寡核苷酸的顺序、纯度和制备方法等有关。
2.RNA合成方案
注意：建议佩戴手套和口罩，使用无核酸酶的试剂和离心管，避免RNA酶污染。标准反应为20 μL，如有需求可测试后进行放大。
（1）将试剂盒中的组分在冰上解冻，震荡混匀后瞬时离心至管底，冰上储存备用。
（2）在室温下按以下顺序配制反应混合液：
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组分 |
加样量 |
终浓度 |
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Nuclease-free Water |
up to 20 μL |
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10X Reaction Buffer |
2 μL |
1X |
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ATP (100 mM) |
2 μL |
10 mM |
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UTP (100 mM) |
2 μL |
10 mM |
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GTP (100 mM) |
2 μL |
10 mM |
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CTP (100 mM) |
2 μL |
10 mM |
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Template DNA |
X μL |
1 μg |
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T7 Enzyme Mix |
2 μL |
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总体积 |
20 μL |
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注：如您需要进行多管反应，可先将10X Reaction Buffer和四种NTP溶液混合后配制预混液以供后续使用，每个标准反应中加入
10 μL预混液。
（3）将反应混合液充分混匀后瞬时离心至管底。37℃孵育2 h。根据需求可适当调整反应时间，如短片段的转录本（＜300 nt）可增加孵育时间至4 h或更长时间。
注：反应过程中要避免溶液蒸发对反应体系的影响。
（4）（可选）在反应体系中加入1 μL的DNase I，37℃孵育15 min，消化转录的DNA模板。
注：相对于产物RNA，模板DNA的含量非常低，一般不用去除，也可以用DNase I消化。
（5）合成的RNA经电泳分析或纯化后进行定量检测，可用于下游实验。
注：通常来说，RNA产物浓度极高，需用Nuclease-free Water稀释后再检测。
- RNA产物纯化
通常，通过标准RNA合成反应生成的未修饰RNA转录物可以通过苯酚-氯仿纯化法、柱纯化法、磁珠纯化法和氯化锂纯化法等方法进行纯化。
（1）苯酚-氯仿纯化法
苯酚-氯仿纯化可以去除蛋白质、大多数游离核苷酸和盐分。
A.加入160 μL Nuclease-free Water将产物溶液体积稀释至180 μL。
B.加入20 μL 3 M醋酸钠（pH 5.2）至稀释后的产物溶液中，充分混合均匀。
C.加入等体积的苯酚/氯仿混合液（1：1）进行抽提，室温或4℃ 10000 rpm离心5 min，取上层水相溶液 至新的Nuclease-free Ep管中。
D.加入与水等体积的氯仿进行2次抽提，每次都收集水相溶液至新的Nuclease-free Ep管中。
E.加入2倍体积的无水乙醇并混匀，-20℃孵育至少30 min，4℃ 12000 rpm离心10-15 min。
F.弃上清，加入500 μL预冷的70%乙醇，冲洗RNA沉淀，4℃ 12000 rpm离心后弃上清。
G.室温开盖干燥2-5 min，加入20-50 μL Nuclease-free Water或其他缓冲液溶解RNA沉淀。
H.纯化后的RNA样品可以进行电泳或定量等分析，长期保存请至于-80℃储存。
（2）柱纯化法
柱纯化可以去除蛋白、游离核苷酸和盐分。
加入80 μL Nuclease-free Water将产物溶液体积稀释至100 μL，充分混合均匀。再按柱纯化说明书进行纯化
注：标准反应产生的RNA量较高，可能超出结合柱的结合能力。纯化前请仔细阅读柱纯化说明书并对所需柱子数量进行预估。
（3）磁珠纯化法
磁珠纯化可以去除蛋白、游离核苷酸和盐分。
按照磁珠纯化说明书进行纯化。
（4）氯化锂纯化法
氯化锂纯化可以去除蛋白质、大多数游离核苷酸和盐分。
A.向20 μL转录产物中分别加入30 μL Nuclease-free Water和30 μL 氯化锂沉淀溶液。
B.充分混合均匀，-20℃放置至少30 min。
C.12000 rpm离心15 min，弃上清，收集沉淀。
D.加入500 μL预冷的70%乙醇，冲洗RNA沉淀，4℃ 12000 rpm离心后弃上清，洗涤3次。
E.室温开盖干燥2-5 min，加入20-50 μL Nuclease-free water或其他缓冲液溶解RNA沉淀。
F.纯化后的RNA样品可以进行电泳或定量等分析，长期保存请至于-80℃储存。
- RNA定量
（1）紫外吸收法
测量260 nm的紫外吸收值可以计算RNA浓度，但混合物中的游离核苷酸和模板DNA会影响定量的准确性。才有此方法进行定量前需先进行RNA纯化以去除转录反应中的游离核苷酸。吸光度读数应在分光光度计线性范围内给出，可根据需要对纯化后的RNA样品进行稀释后测定。RNA浓度在10 ng/μL – 3000 ng/μL范围内时，可以不经稀释直接用NanoDrop分光光度计读数。
对应单链RNA，A260下读值为1表示40 μg RNA/mL。样品RNA浓度（μg/mL）计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40μg/mL= μg/mL RNA。
（2）染料法
用RiboGreen染料进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或未纯化的RNA产物进行准确定量。
五.常见问题&注意事项
- 质粒模板必须线性化么？
环状质粒或线性化的质粒均可作为T7 RNA聚合酶的模板。T7 RNA聚合酶可以围绕环状质粒模板转录多次而不解离。以环状质粒作为模板，由于没有有效的终止，易产生过长的RNA产物，故推荐将质粒先进行线性化，回收后再作为转录模板。
- 质粒模板线性化时，如何选择限制性内切酶？
质粒的线性化和纯度会影响转录的产量和RNA的完整性。为了得到特定长度的RNA，质粒可以用限制性内切酶线性化，产生平头末端或5'突出末端。因此，需要选择可以产生平头末端或5'突出末端的限制性内切酶，且模板DNA上不含有该限制性内切酶的识别序列。
- T7 RNA聚合酶介导的转录反应需要引物吗？
不需要。T7 RNA聚合酶识别特定的启动子序列（5'-TAATACGACTCACTATA-3'），并在随后的G开始起始转录，然后T7 RNA聚合酶使用相反的链作为模板进行转录。
- T7 RNA聚合酶可以以单链DNA为模板进行转录吗？
启动子序列区域必须是双链的，转录模板可以是单链也可以是双链。
- 使用T7 RNA聚合酶如何使RNA的产量最大化？
通过提高NTP/Mg2+浓度、DNA模板量和T7 RNA聚合酶的量，可以获得更高的RNA产率。雅心的T7高产量RNA合成试剂盒已经过优化，可用于合成高产量的RNA。
- 转录产物产量低或转录失败
（1）DNA模板中可能存在污染物（如高浓度的盐、有机溶剂等）抑制RNA聚合酶的活性，或者可能由于DNA 模板的浓度不正确。建议重新纯化模板，确定模板定量和完整性。
（2）体系中存在RNA酶污染，使RNA产物降解（Enzyme Mix中包含RNA酶抑制剂，可以防止大部分RNase污染所导致的RNA降解）。建议所用耗材和试剂均保证为RNase-free。
（3）DTT是RNA聚合酶活性所必须的，缓冲液时间过久或保存不当可能会导致DTT失效。建议适当补充新鲜 的DTT。
- 短转录本产量较低
短转录本（＜0.3 kb）可通过延长反应时间或增加模板量来提高RNA产量。
- RNA产物大于预期大小
（1）质粒模板可能未被完全线性化，即使少量的未被完全线性化的环状质粒，都能产生大量的长转录本。建议重新线性化质粒模板，确保质粒模板完全线性化，且线性化的片段为平头末端或5'突出末端。
（2）当RNA转录本由于产量过高或存在较强二级结构而不完全变性时，电泳图片上也可以观察到较大条带。建议稀释后电泳、加热完全变性RNA或采用变性胶检测RNA产物。
- RNA产物小于预期大小
(1)模板序列中包含类似于T7 RNA聚合酶的终止序列，会导致RNA转录反应提前终止。建议更换RNA聚合酶尝试或更换模板序列。
(2)模板中存在高级结构，阻碍T7 RNA聚合酶的持续转录。建议加入SSB蛋白尝试或提高转录温度尝试。
(3)体系中存在RNase污染。建议所用耗材和试剂均保证为RNase-free。
