K2-ET01 通用型磁珠法宿主残留DNA样本前处理试剂盒
通用型磁珠法宿主残留 DNA 样本前处理试剂盒
使用说明书
1.试剂盒简介
本试剂盒适用于生物制品样本中宿主残留 DNA 检测的前处理。采用磁珠法 DNA 提取原理，可最大限度的分离纯化样本中的宿主残留 DNA，实现从不同复杂基质中回收微量 DNA 样本。采用高吸附的磁珠和优化的缓冲体系，可高效稳定地提取样本中的微量宿主细胞残留 DNA。
该前处理试剂盒可与本公司的多种宿主细胞残留 DNA 检测试剂盒（qPCR 法）配套使用，包括E.coli 残留 DNA 检测试剂盒（Cat#K2-HCD01）、CHO 宿主细胞残留 DNA 检测试剂盒 （Cat#K2-HCD02）和 Vero 宿主细胞残留 DNA 检测试剂盒（Cat#K2-HCD03）等。
2.试剂盒组分
规格：25 Extracts /100 Extracts
注：洗涤液 A*在使用前需加入9 mL（25 Extracts）或36 mL（100 Extracts）乙醇，洗涤液 B*在使用前需加入12 mL
（25 Extracts）或48 mL（100 Extracts）乙醇，并做好标记；试剂在使用前需充分混匀；使用后将瓶盖盖紧，以防止乙醇挥发。如长期保存可将磁珠悬浮液置于4℃,确保磁珠的结合活性。
3.有效期
规定储存条件下12 个月，具体详见试剂盒标签。
4.运输条件
组分I 室温运输，室温保存；组分II 冰袋或干冰运输，-20℃保存。
5.注意事项
1. 检测之前请仔细阅读本说明书，按照说明书内容进行规范操作，样本处理建议在超净台或生物安全柜中进行。
2. 使用该试剂盒前，注意观察常温保存溶液是否有析出或者沉淀，若溶液发生沉淀，放置于37℃水浴中，以溶解沉淀。试剂使用前请振荡混匀并瞬时离心至管底。
3. 吸取样本时应尽量避免吸入磁珠，磁珠易沉淀使用前请振荡混匀。
4. 试剂使用结束后尽快放置推荐的储存条件下，避免在常温或高温条件下存放时间过长。
5. 所用Ep管、枪头等耗材需无菌、无核酸酶。
6.实验所需但试剂盒中未含材料
10 μL、100 μL、1000 μL 不等的低吸附带滤芯枪头
1.5 mL 低吸附离心管
无水乙醇（分析纯）
1×PBS 缓冲液（pH 7.4，无 Mg 2+和 Ca 2+离子），无菌，无核酸酶
超纯水
7.实验所需但试剂盒中未含设备
漩涡振荡器
水浴锅或金属浴
瞬时离心机
磁力架
10 μL、100 μL、1000 μL 移液枪
超净台或生物安全柜
8.提取操作过程
1. 样本制备
1.1 待测样本为疫苗等本身含有较高的 DNA 含量的样本，为了保证检测的准确性，使样品的检测
值在标准曲线线性范围之内，可用 1×PBS（pH7.4，无 Mg 2+和 Ca 2+离子）对样本进行适当比例稀
释后提取，样本稀释后，以空白基质稀释液作为阴性样本。
1.2 待测样本为干粉的，可用超纯水或 1×PBS 将样本稀释成 10 mg/mL 或者 100 mg/mL 后使用。
1.3 待测样本为复杂背景基质的，可根据需要进行加标回收实验，以确定合适的样本稀释倍数。
1.4 一般情况下生物制品纯化过程中间样品的 pH 值均为中性，若样品的 pH<5 或者 pH>9，则会影
响样品纯化处理效果。若样品的 pH 值不为中性，可用 1M 的盐酸或氢氧化钠调整样品的 pH 至中
性后（pH 6.0～8.0）再进行纯化操作。
1.5 为了确保结果的准确性，每个待测样本建议至少进行 2 次 DNA 提取处理。
1.6 每次实验中需要设置一个阴性样本 NCS，与其余样本一起处理，以检验样本处理过程中是否存
在污染。
1.7 用加标回收样本（ERC）来评估 DNA 提取的回收率和准确度，并可用 ERC 来评估验证分析方
法和系统性能。对具体样品的 DNA 加标量设定在其无加标测试值的 2-10 倍为宜（可参考相应的宿
主细胞残留 DNA 检测试剂盒）。
2. 蛋白酶 K 处理
2.1 将 100 µL 的样本，阴性样本和加标回收样本加入 1.5 mL 的离心管中；
2.2 每管加入 100 μL 蛋白酶 K 反应液和 10 µL 蛋白酶 K，涡旋充分混匀；
【注】：样本蛋白浓度 0-100 mg/mL，蛋白酶 K 用量为 10 μL；样本蛋白浓度 100-200 mg/mL，蛋白酶 K 用量
为 20 μL。
2.3 60℃孵育 20 min，室温放置 3-5 分钟。
3. 核酸-磁珠结合
3.1 加入 400 μL 结合液、9 μL 糖原和 6 μL 核酸助沉剂，涡旋混匀 3-5 s 后，瞬时离心 5-10 s；
3.2 在样品混合物中加入 20 μL 磁珠，漩涡混匀后放置 10 min，每隔 2-3 min 涡旋混匀 3-5 s；
【注】：磁珠使用前应在漩涡振荡器充分振荡 5 s；如果样品较多，每次加入磁珠过程中应再次充分震荡混匀磁
珠，以保证每次加入的磁珠量的一致性。
3.3 短暂离心收集悬液至管底，然后将离心管置于磁力架上，室温静置至溶液澄清（等待磁珠完全
分离的时间约为 1-2 min）；
3.4 保持离心管于磁力架上，避免震动，用 1 mL 移液器小心吸去大部分溶液；
【注】：去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。
3.5 继续保持离心管于磁力架上 1 min，用 200 µL 移液器吸去残余上清。
4. 洗涤
4.1 加入 500 μL 洗涤液 A（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），涡旋混匀，确保磁珠分散，
离心管壁无聚集磁珠；
4.2 瞬时离心后将离心管重置于磁性分离架上，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，
完成第 1 次磁珠洗涤；
4.3 加入 500 μL 洗涤液 B（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），涡旋混匀，确保磁珠分散，
离心管壁无聚集磁珠；
4.4 瞬时离心后将离心管重置于磁性分离架上，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，
完成第 2 次磁珠洗涤；
4.5 为保证液体充分移除，可将离心管再次瞬时离心 10 s，置于磁性分离架上，待磁珠完全分离后，
用 10 μL 枪头小心地将残余液体吸除干净。
4.6 打开管盖，室温放置 3-5 min 直至乙醇完全挥发。肉眼观察到磁珠表面无反光或出现裂隙即表
明乙醇已挥发完全。
【注】：避免磁珠过分干燥，导致磁珠粘在管壁上降低回收率。
5. 洗脱
5.1 将离心管放入常规离心管架，沿离心管壁加入 50-100 μL 65℃预热的洗脱液，用漩涡振荡器轻
微振荡 5 s 使磁珠和洗脱液混匀，65℃水浴 5-10 min，水浴过程中可再次振荡混匀 2-3 次；
【注】：振荡后需将残留于管壁上的磁珠和洗脱液轻甩至管底，振荡至管盖上的磁珠和洗脱液需快速离心后重
新震荡混匀。
5.2 孵育后瞬时离心，将离心管盖上吸附的液体收集到底部后，将离心管置于磁力架上静置 2 min，
等待样本温度恢复到室温水平，磁珠成团贴壁，液体变清澈；
5.3 将 DNA 溶液移至新的 1.5 mL 离心管中，随即进行样本检测。短期保存于-20℃，长期保存需
放置于-80℃。
【注】：收集洗脱液时，应将离心管内溶液转移完全，离心管内不得残留液体，否则将影响样品检测的准确性。
9.操作注意细节
在磁珠洗涤或洗脱过程中，每次震荡混匀后都要用瞬时离心机短暂离心，以保证没有磁珠液附
着在离心管管盖和管壁上；
磁珠的干燥时间依具体情况而定，室温较高或空气干燥的环境下可以选择较短干燥时间；而室
温较低或空气湿润环境下，干燥时间可以稍长；
在去除乙醇干燥时，观察磁珠状态，勿让磁珠太干，以免洗脱不完全；
尽量在完成样品前处理纯化后就立即进行后续 DNA 检测，以保证检测结果的准确性。
