K2-HCD01 E.coli残留DNA检测试剂盒（qPCR-荧光探针法）
E.coli残留DNA检测试剂盒（qPCR-荧光探针法）
使用说明书
1.试剂盒简介
E. coli残留DNA检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的E. coli残留DNA含量的专用试剂盒。本试剂盒利用探针法荧光定量PCR原理，定量检测样品中E. coli残留DNA含量。专一性强、检测快速、性能稳定，最低检测限可以达到fg水平。
本试剂盒配套的E. coli DNA定量参考品，已溯源至国家标准品，可准确定量样品中E. coli残留DNA。
2.试剂盒组分
试剂盒规格：100 Reactions
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组分编号 |
组分规格 |
储存条件 |
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E. coli qPCR Mix |
K2-HCD01-A |
700 μL×2管 |
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E. coli Primer&Probe Mix |
K2-HCD01-B |
220 μL |
-20 ℃，避光 |
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E. coli DNA定量参考品（30 ng/μL） |
K2-HCD01-C |
50 μL |
-20 ℃ |
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DNA稀释液 |
K2-HCD01-D |
1.2 mL×4管 |
-20 ℃ |
【说明】
(1) 试剂盒所有组分请于-20℃及以下保存，E. coli Primer&Probe Mix需避光。
(2) 本试剂盒中不含ROX参比染料，如您所用仪器需要添加ROX参比染料，需单独购买。
3.有效期
规定储存条件下18个月。
4.适用机型（包括但不限于）
Thermo Scientific：ABI 7500、QuantStudio™ 5
Bio-Rad：CFX96
上海宏石：SLAN-96S
(1) 检测之前请仔细阅读本说明书，按照说明书内容进行规范操作。
(2)每个组分均在冰上或低温下融化，避免温度过高，使用前请振荡混匀并瞬时离心至管底。
(3)加样和配液过程请在超净台中分区进行，避免时间过长，如时间较长请尽量在冰上进行。
(4)试剂使用结束后尽快放置推荐的储存条件下，避免在常温或高温条件下存放时间过长。
(5)所用EP管、PCR管、枪头等耗材需无菌和无核酸酶。
6.操作过程
(1) E. coli DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备
E. coli DNA定量参考品的浓度标注于管壁标签，请确认后再进行稀释。
以E. coli DNA定量参考品30 ng/μL为初始浓度，用DNA稀释液将参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。具体操作如下：
A.将试剂盒中的DNA定量参考品和DNA稀释液置于冰上或2-8℃条件下融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，瞬时离心3-5 s。
B.取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为3 ng/μL，ST①，ST②，ST③，ST④，ST⑤。
C.在标记为3 ng/μL的离心管中加入90 μL DNA稀释液和10 μL DNA定量参考品（30 ng/μL），即稀释为3 ng/μL，瞬时振荡混匀后短时间快速离心3-5 s，重复2-3次确保定量参考品与DNA稀释液充分混匀。该浓度可分装置于-20℃及以下温度短期保存（不超过1个月），使用时避免反复冻融。
D.在ST①，ST②，ST③，ST④，ST⑤管中先分别加入90 μL DNA稀释液，再进行梯度稀释，稀释方法如下：
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稀释管 |
稀释比例 |
终浓度 |
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ST① |
10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA稀释液 |
300 pg/μL |
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ST② |
10 μL ST①+90 μL DNA稀释液 |
30 pg/μL |
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ST③ |
10 μL ST②+90 μL DNA稀释液 |
3 pg/μL |
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ST④ |
10 μL ST③+90 μL DNA DNA稀释液 |
300 fg/μL |
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ST⑤ |
10 μL ST④+90 μL DNA稀释液 |
30 fg/μL |
【说明】
（1）已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃，如长时间不用，请放置于-20℃。
（2）初次使用时将DNA定量参考品分装储存，减少反复冻融次数和避免污染。
（3）标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，如需要，而可用适当扩大或缩小线性范围。
（4）每个梯度稀释时需轻微振荡并瞬时离心后再吸取，确保模板完全混匀。
（5）使用带滤芯的枪头，并每次更换枪头，注意规范操作，避免管与管直接的交叉污染。
(2)不同对照样品的制备
样品加标回收质控ERC（Extraction Recovery Control）的制备
根据需要设ERC中的E.coli DNA标准品浓度（以制备加3 pg/μL的E.coli DNA样品为例）。具体操作如下：
A. 取50 μL待测样品（Test Sample，TS）加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入50 μL ST③，混匀，标记为加标回收ERC；
B. 加标回收ERC和同批待测样品一起进行样品前处理，制备加标回收ERC纯化液。
标准品回收质控SRC（Standards Recovery Control，SRC）的制备（可选）
根据需要设SRC中的E.coli DNA 标准品浓度（以制备加3 pg/μL的E.coli DNA样品为例），具体操作如下：
A. 取100 μL ST③加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为标准品回收SRC；
B. 标准品回收SRC和同批待测样品一起进行样品前处理，制备标准品回收SRC纯化液。
阴性质控NCS的制备
根据实验设置阴性质控，具体操作如下：
A. 取100 μL样品回收溶液（或DNA稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为阴性质NCS；
B.阴性质控NCS和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。
无模板对照NTC的制备
根据实验设置无模板对照NTC，无模板对照NTC无需进行样品前处理，在qPCR反应液的制备和加样阶段开始配制即可。
A. 根据所要检测的标准曲线和待测样品数量，计算所需反应孔数，每个样品通常需做3个重复孔。
反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线 + 1个阴性质控NCS + 1个无模板对照NTC + n个样品加标回
收质控ERC + n个待测样品 + 标准品回收质控SRC(可选)）× 3
【说明】通常推荐每个待测样品都需要做ERC，如几个待测样品为同一产品，可只做一个。
B. 根据反应孔数，将除模板外的组分混合成Mix反应液，各试剂置于冰上或低温下融化，轻微振荡混匀，加样。
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组分 |
体积 |
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E. coli qPCR Mix |
13 μL |
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E. coli Primer&Probe Mix |
2 μL |
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DNA template |
10 μL |
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Total |
25 μL |
C. 将配制的Mix反应液充分混匀后，分装，加入DNA模板。加样完成后密封好管子，低速离心后混匀再低速离心，完全混匀反应液，如有气泡，需将气泡排尽。
下表为96孔板排位示例
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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NTC |
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S1 ERC |
S1 ERC |
S1 ERC |
S1 |
S1 |
S1 |
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B |
NTC |
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ST① |
ST① |
ST① |
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S2 ERC |
S2 ERC |
S2 ERC |
S2 |
S2 |
S2 |
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C |
NTC |
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ST② |
ST② |
ST② |
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S3 ERC |
S3 ERC |
S3 ERC |
S3 |
S3 |
S3 |
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D |
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ST③ |
ST③ |
ST③ |
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S4 ERC |
S4 ERC |
S4 ERC |
S4 |
S4 |
S4 |
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E |
NCS |
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ST④ |
ST④ |
ST④ |
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S5 ERC |
S5 ERC |
S5 ERC |
S5 |
S5 |
S5 |
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F |
NCS |
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ST⑤ |
ST⑤ |
ST⑤ |
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G |
NCS |
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SRC |
SRC |
SRC |
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H |
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【说明】
该示例展示的是用本试剂盒检测5个样品的E. coli DNA残留量。包括：5个浓度梯度的E.coli DNA标准曲线（ST① - ST⑤）、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、5个样品加标回收质控ERC、5个待测样品、1个标准品回收质控SRC。每个样本至少做3个重复孔。
(4) 扩增程序参数设置
在荧光定量PCR仪器上进行扩增程序设置：设置反应体积25 μL。
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循环步骤 |
温度（℃） |
时间 |
循环数 |
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预变性 |
95℃ |
5 min |
1 |
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变性 退火/延伸（收集荧光） |
95℃ 60℃ |
20 s 30 s |
40 |
以ABI 7500 v2.3为例
A.创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。在Experiment Properties界面选择7500（96 Wells）、Quantitation-Standard Curve、TaqMan Reagents
B.在Plate Setup界面设置检测探针和样本。在“Define Targets and Samples”面板中创建1个检测探针（Define Targets），命名为“E.coli DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，淬灭基团为“none”；创建样本（Define Samples），ST① - ST⑤、NTC、NCS、ERC、S、SRC。
C.在“Assign Targets and Samples”面板中，将标准曲线的“Task”一栏设置为“Standard”（
），并在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（即每孔加入的参考品浓度，单位为fg/μL），对应样本（Sample）一栏选择“ST①”、“ST②”、“ST③”、“ST④”、“ST⑤”；无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“Negative Control”（
），对应样本（Sample）一栏选择“NTC”；将阴性质控NCS孔、样品加标回收质控ERC孔、待测样品孔和标准品回收质控SRC孔（可选）的“Task”一栏设置为“Unknown”（
），对应样本（Sample）一栏选择“NCS”、“ERC”、“S”和“SRC”。
D.在“Run Method”面板中，按扩增程序参数设置反应程序，反应体积为25 μL。
E.点击右上角的“START”开始程序。
(5)结果分析
以ABI 7500 v2.3为例
进入Analysis板块
A.在Amplification Plot界面中，系统会自动给出Threshold，可根据需要手动调节Threshold至合适位置，结束后点击“Analyze”。可以在“Multiple Plots View”查看扩增曲线形态是否正常，如果三个复孔中其中一个差异较大，可舍去。
B.在Standard Curve界面中，读取标准曲线的R2、扩增效率（Eff%）、斜率（Slope）、截距（Y-Inter）等。
正常的标曲：R2>0.99；扩增效率在90%-110%之间。
C.在右边的“View Well Table”面板中，“Quantity”一栏中可以读取不同样品的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算为所需单位。
D.无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35.00，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。
E.阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct均值。
以宏石SLAN-96S为例
宏石SLAN-96S不能自动计算标准曲线和样品检测值，需手动计算。
A.绘制标准曲线
将标准品对应的检测值填写在下表的对应位置，并计算平均Ct值。
以标准品浓度的LOG值为横坐标，Ct值的平均值为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程：y = -kx + b。
B.查看NTC和NCS是否符合标准
无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35.00，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。
阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct均值。
C.根据标准曲线计算待测样品的浓度
将待测样品对应的检测值填写在下表的对应位置，并计算平均Ct值。
将平均Ct值（y值）代入标准曲线方程，计算x值，检测样品的浓度为10^x fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算为所需单位。
