K0603-RSN 重组全能核酸酶酶联免疫吸附活性测定试剂盒
重组全能核酸酶酶联免疫吸附活性测定试剂盒
使用说明书
（96T）
使用前请仔细阅读说明书（注意事项），避免浪费您的时间和成本。
试剂盒用途
本试剂盒用于体外定量检测核酸酶蛋白活性残留量。本试剂盒仅供研究和工业生产使用。
试剂盒基本参数
灵 敏 度：≤ 0.472 U /mL
检测范围：0.312 -80 U/mL
特 异 性：可检测重组核酸酶，与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。
重 复 性：板内，板间变异系数均< 15%。
工作时间：熟练实验人员可在1-1.5小时内完成一次测定。
有 效 期：6个月
试剂盒检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测样品中的重组全能核酸酶活性含量。以抗重组全能核酸酶的抗体包被酶标板，样品或标准品中的重组全能核酸酶与包被抗体结合，另一辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗重组全能核酸酶的抗体与上述抗原-抗体复合物结合，以TMB为显色体系，在450 nm波长（参考波长650 nm）处测OD值，重组核酸酶浓度与 OD 值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中重组核酸酶的活性浓度。
试剂盒组成及保存
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中文名称 |
规格 |
储存条件 |
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抗体包被的ELISA酶标板（96孔可拆卸) |
8孔×12条 |
2-8℃ |
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冻干标准品（40 U/支）(A1) |
4支 |
2-8℃ |
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辣根过氧化物酶化抗体浓缩液 (A2) |
1瓶×0.03 mL |
-20℃避光 |
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浓缩标准品&样品稀释液&HRP-抗体稀释液（25X）(P1) |
1瓶×5 mL |
2-8℃ |
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浓缩洗涤液（25X）(P2) |
1瓶×20 mL |
2-8℃ |
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显色液A (P3) |
1瓶×8 mL |
2-8℃ |
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显色液B (P4) |
1瓶×8 mL |
2-8℃ |
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反应终止液 (P5) |
1瓶×6 mL |
2-8℃ |
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封板覆膜 |
5张 |
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避光袋 |
1份 |
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产品说明书 |
1份 |
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质检报告 |
1份 |
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说明:
1.所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。
2.拆封后的试剂盒可在4℃保存，请在一周内使用完毕。
3.酶标抗体（A2）始终置于-20℃储存。
试验所需自备物品
1.酶标仪（滤光片波长450 nm和650 nm）
2.洗板机
3.高精度移液器，EP管、一次性吸头及洁净试管
4.37℃恒温箱，纯化水
5.洁净吸水纸
待测样品注意事项
1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或 -80℃（3个月内检测），避免反复冻融。未知样品应先离心取上清液进行上样操作，混悬液等样品影响测定结果。
2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释后再测。
3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液或自有稀释溶液，可能由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
检测前准备工作
1.稀释液配制
将浓缩标准品&样品&HRP-抗体稀释液用纯化水稀释（1：24）。
2.洗涤液配制
将浓缩洗涤液用纯化水稀释（1：24）。
提示:从冰箱中取出的样品稀释液或浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液温度应为室温）。所配工作液请当次实验使用，不建议多轮试验重复使用。
3.标准品配制
将标准品于1000转/分离心1分钟，加入的标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置1-2分钟，用移液器将其轻轻混匀（浓度为25 U/mL），待其充分溶解后，然后进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。使用者可以根据实验需要稀释所需的浓度梯度配置。以40 U/mL上限浓度点为例，配制以下浓度:40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0 U/mL。样品稀释液直接作为空白孔0 U/mL。
取7只EP管，每管中加入500 μL标准品&样品稀释液，从40 U/mL的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL样品稀释液的EP管中混匀配成20 U/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。
1.自动洗板机：每孔加入洗涤液350 μL，注入和吸出间隔60秒。
2.手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净厚吸水纸（或干布）上拍干，每孔加入洗涤液350 μL（此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗），浸泡45-60秒，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。
提示：推荐使用洗瓶冲洗，洗涤液溢出板孔不影响实验结果。若使用排枪，建议每次洗涤更换枪头，加样槽请不要与其他试剂混用，避免污染。
1.加样：将标准品工作液依次加入到板孔中，（此处建议每个浓度的工作液至少做2个复孔），每孔50 μL。待测样品加入到其他孔，每孔50 μL。随后，每孔中加入HRP-抗体工作液50 μL。加样完成后，轻微震荡10-15秒混匀，将酶标板覆膜并置于37℃条件下，避光静置孵育45分钟。
1)加样时应按照先样品后抗体的顺序加样。将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁。加入标记抗体时避免接触孔内液面造成样品间污染。加样时间尽量控制在10分钟内。
2)加样完毕后，应用微孔板振荡仪最低频率或手指轻微敲击酶标板四周10-15秒，已达到混匀的目的。切忌猛烈震荡使液体飞溅，影响实验结果。
3)无避光条件，可将酶标板置于避光袋中，于37℃条件下孵育。
2. 洗涤：洗板机洗板：设置350 μL/孔洗涤液加液量，浸泡45-60秒，重复5次。
手工洗板：弃去板内液体，甩干，在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μL，浸泡45-60秒，重复此洗板步骤5次。
3.显色：每孔依次加入显色工作液A 50 μL/孔和显色工作液B 50 μL/孔。酶标板覆膜并置于37℃条件下避光孵育10分钟。
1)推荐使用排枪及加样槽加入显色工作液及终止液，尽量缩小由于加样时差造成的显色差异。
2)根据实际显色情况酌情缩短或延长，显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。
4.终止：每孔加终止液50 μL，终止反应，终止反应后静置2-3分钟后，尽快读数。
提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头应避免接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。
5.读数：用酶标仪在450 nm波长（参考波长650 nm）测量各孔的光密度（OD450/650 nm值）。
1.计算每组板孔的OD值或复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标（X），OD值为纵坐标（Y），绘出标准曲线（作图时亦可去掉空白组的值）。
2.推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或ELISA Calc（建议使用Logistic四参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线）等。
由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
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3.加样：加样和加同一试剂时，第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间，从而明显的影响到测量值的准确性及重复性，每次的加样时间最好控制在10分钟之内，推荐设置复孔。
4.温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜，洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。
7.显色时间的控制：第一次使用本试剂盒时，在加入底物后，请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔5分钟），如梯度已经很明显，请提前加终止液终止反应，以避免颜色过深，影响酶标仪读数。
8.底物：请避光保存底物。在储存和温育时，避免强光直接照射。
9.混匀：加入样品和酶标抗体后，充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器，使用最低频率，如无微量振荡器，可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
1)由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等）等原因可能导致，复孔间平行度差异较大。建议在合理的取值范围内，以复孔读数的平均值为计算数值。
2)酶标仪差异分析：酶标仪具有450 nm和650 nm滤光片，可直接设置主/参波长进行读数；若酶标仪只具有450 nm滤光片，亦可直接读数计算，但整体显色数值会偏高0.05-0.10范围内，不影响标准曲线构建和样品浓度计算。
3)由于实验条件和操作习惯的差异性，可能会引起显色液轻微污染或本底偏高的现象。建议酶标仪设置选项直接设置：OD值减去空白孔的OD值作为矫正值，再行构建标准曲线和计算样品浓度。
本实验室测试数据表明：2-8℃试剂盒整体存放7天（货架时间）不影响试剂盒性能，-20℃试剂盒整体存放1个月（货架时间）不影响试剂盒性能。
若实验结果有问题，请及时对显色结果拍照，并妥善保存未使用板条及试剂，然后联系技术支持。也可参考以下信息以找出原因。
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