K0202-RPT 重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒(二代)
重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒(二代)
使用说明书
(96T)
使用前请仔细阅读说明书(注意事项),避免浪费您的时间和成本。
试剂盒说明:
1.重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒(二代)采用“一步法”加样策略,无需二次添加抗体步骤,较重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒一代产品,样品用量节省50%,操作时间缩短50%以上。
2.重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒(二代)采用新显色系统,底物更稳定,降低交叉污染风险,更易操作。
试剂盒用途
本试剂盒用于体外定量检测大肠菌液体中重组胰蛋白酶含量。本试剂盒仅供研究和工业生产使用。
试剂盒基本参数
灵 敏 度:≤ 0.039 ng/mL
检测范围:0.078 - 40 ng/mL
特 异 性:可检测重组胰蛋白酶,与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。
重 复 性:板内、板间变异系数均< 15%。
工作时间:熟练实验人员可在1-1.5小时内完成一次测定。
有 效 期:6个月
试剂盒检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)定量检测样品中的重组胰蛋白酶蛋白含量。以抗重组胰蛋白酶抗体包被酶标板,样品或标准品中的重组胰蛋白酶与包被抗体结合,随之加入的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗重组胰蛋白酶抗体与上述抗原-抗体复合物结合,以TMB为显色体系,在450 nm波长(参考波长650 nm)处测OD值,重组胰蛋白酶浓度与 OD 值之间呈正比,通过绘制标准曲线计算出样品中重组胰蛋白酶的蛋白浓度。
试剂盒组成及保存
中文名称 |
规格 |
储存条件 |
抗体包被的ELISA酶标板(96孔可拆卸) |
8孔×12条 |
2-8℃ |
冻干标准品(10 ng/支)(A1) |
4支 |
2-8℃ |
辣根过氧化物酶化抗体浓缩液 (A2) |
1瓶×0.03 mL |
-20℃避光 |
浓缩标准品&样品稀释液&HRP-抗体稀释液(25X)(P1) |
1瓶×5 mL |
2-8℃ |
浓缩洗涤液(25X)(P2) |
1瓶×20 mL |
2-8℃ |
显色液A (P3) |
1瓶×8 mL |
2-8℃ |
显色液B (P4) |
1瓶×8 mL |
2-8℃避光 |
反应终止液 (P5) |
1瓶×6 mL |
2-8℃ |
封板覆膜 |
5张 |
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避光袋 |
1份 |
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产品说明书 |
1份 |
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质检报告 |
1份 |
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说明:
1.所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。
2.拆封后的试剂盒可在4℃保存,请在一周内使用完毕。
3.酶标抗体(A2)始终置于-20℃储存。
试验所需自备物品
1.酶标仪(滤光片波长450 nm和650 nm)
2.洗板机
3.高精度移液器,EP管、一次性吸头及洁净试管
4.37℃恒温箱,纯化水
5.洁净吸水纸
待测样品注意事项
1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或 -80℃(3个月内检测),避免反复冻融。未知样品应先离心取上清液进行上样操作,混悬液等样品影响测定结果。
2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围,如果样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释后再测。
3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液或自有稀释溶液,可能由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
检测前准备工作
1.稀释液配制
将浓缩标准品&样品&HRP-抗体稀释液用纯化水稀释(1:24)。
2.洗涤液配制
将浓缩洗涤液用纯化水稀释(1:24)。
提示:从冰箱中取出的样品稀释液或浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超过50℃,使用时洗涤液温度应为室温)。所配工作液请当次实验使用,不建议多轮试验重复使用。
3.标准品配制
将标准品于1000转/分离心1分钟,加入的标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中,旋紧管盖,静置1-2分钟,用移液器将其轻轻混匀(浓度为10 ng/mL),待其充分溶解后,然后进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。使用者可以根据实验需要稀释所需的浓度梯度配置。以10 ng/mL上限浓度点为例,配制以下浓度: 10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0 ng/mL。样品稀释液直接作为空白孔0 ng/mL。
4.HRP标记抗体工作液配制
HRP标记抗体应始终置于-20℃保存,请勿室温平衡,随用随取。首次使用时请先将抗体管低速离心,以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制
100-200 μL。使用前3-5分钟,用抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度(抗体:稀释液 = 1:250),建议即配即用。
倍比稀释方法示例
取7只EP管,每管中加入500 μL标准品&样品稀释液,从10 ng/mL的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL样品稀释液的EP管中混匀配成5 ng/mL的标准品工作液,按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。
标准品稀释图例(以500 μL为例)
提示:最后一管直接作为空白孔。
洗涤方法
1.自动洗板机:每孔加入洗涤液350 μL,注入和吸出间隔60秒。
2.手工洗板:甩尽孔内液体,在洁净厚吸水纸(或干布)上拍干,每孔加入洗涤液350 μL(此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗),浸泡45-60秒,吸去(不可触及板壁)或甩掉板内液体,在洁净厚吸水纸上拍干。
提示:推荐使用洗瓶冲洗,洗涤液溢出板孔不影响实验结果。若使用排枪,建议每次洗涤更换枪头,加样槽请不要与其他试剂混用,避免污染。
操作步骤
1.加样:将标准品工作液依次加入到板孔中,(此处建议每个浓度的工作液至少做2个复孔),每孔50 μL。待测样品加入到其他孔,每孔50 μL。随后,每孔中加入HRP-抗体工作液50 μL。加样完成后,轻微震荡10-15秒混匀,将酶标板覆膜并置于37℃条件下,避光静置孵育45分钟。
提示:
1)加样时应按照先样品后抗体的顺序加样。将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁。加入标记抗体时避免接触孔内液面造成样品间污染。加样时间尽量控制在10分钟内。
2)加样完毕后,应用微孔板振荡仪最低频率或手指轻微敲击酶标板四周10-15秒,已达到混匀的目的。切忌猛烈震荡使液体飞溅,影响实验结果。
3)无避光条件,可将酶标板置于避光袋中,于37℃条件下孵育。
2.洗涤:洗板机洗板:设置350 μL/孔洗涤液加液量,浸泡45-60秒,重复5次。
手工洗板:弃去板内液体,甩干,在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μL,浸泡45-60秒,重复此洗板步骤5次。
3.显色:每孔依次加入显色工作液A 50 μL/孔和显色工作液B 50 μL/孔。酶标板覆膜并置于37℃条件下避光孵育10分钟。
提示:
1)推荐使用排枪及加样槽加入显色工作液及终止液,尽量缩小由于加样时差造成的显色差异。
2)根据实际显色情况酌情缩短或延长,显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。
4.终止:每孔加终止液50 μL,终止反应,终止反应后静置2-3分钟后,尽快读数。
提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头应避免接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。
5.读数:用酶标仪在450 nm波长(参考波长650 nm)测量各孔的光密度(OD450/650 nm值)。
提示: 请提前打开酶标仪电源,预热仪器,设置检测程序。
结果判断
1.计算每组板孔的OD值或复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标(X),OD值为纵坐标(Y),绘出标准曲线(作图时亦可去掉空白组的值)。
2.推荐使用专业的曲线制作软件,如curve expert 1.3或ELISA Calc(建议使用Logistic四参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线)等。
3.回收率:80-120%范围内。
4.若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测。
5.若标准曲线R2值< 0.990,应当重新测定。
6.典型数据
由于实验操作条件的不同(如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等),标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
X-浓度(ng/mL) |
10 |
5 |
2.5 |
1.25 |
0.625 |
0.312 |
0.156 |
0 |
Y-OD450/650 nm |
1.929 |
1.501 |
0.962 |
0.534 |
0.295 |
0.145 |
0.081 |
0 |
注意事项
3.加样:加样和加同一试剂时,第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间,从而明显的影响到测量值的准确性及重复性,每次的加样时间最好控制在10分钟之内,推荐设置复孔。
4.温育:为防止样品蒸发,实验时必须给酶标板覆膜,洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。
7.显色时间的控制:第一次使用本试剂盒时,在加入底物后,请定时观察反应孔的颜色变化(比如每隔5分钟),如梯度已经很明显,请提前加终止液终止反应,以避免颜色过深,影响酶标仪读数。
8.底物:请避光保存底物。在储存和温育时,避免强光直接照射。
9.混匀:加入样品和酶标抗体后,充分轻微混匀对反应结果尤为重要,最好使用微量振荡器,使用最低频率,如无微量振荡器,可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
1)由于实验操作条件的不同(如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等)等原因可能导致,复孔间平行度差异较大。建议在合理的取值范围内,以复孔读数的平均值为计算数值。
3)由于实验条件和操作习惯的差异性,可能会引起显色液轻微污染或本底偏高的现象。建议酶标仪设置选项直接设置:OD值减去空白孔的OD值作为矫正值,再行构建标准曲线和计算样品浓度。
2)不同计量方法以及产品纯度的差别可以导致不同来源、不同批次产品中胰蛋白酶的蛋白含量不完全一致,也会造成回收率的差异。为避免上述因素影响,建议将用作回收率测试的样品采用分光光度法
(A280 nm)估算蛋白含量,再稀释至适合的浓度用于回收率测试,尽量减少回收率的误差。
本实验室测试数据表明:2-8℃试剂盒整体存放7天(货架时间)不影响试剂盒性能,-20℃试剂盒整体存放1个月(货架时间)不影响试剂盒性能。
问题分析
若实验结果有问题,请及时对显色结果拍照,并妥善保存未使用板条及试剂,然后联系技术支持。也可参考以下信息以找出原因。
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