重组蛋白酶

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产品信息•重组蛋白酶

Honorary Certificate

重组羧肽酶B试剂盒
重组羧肽酶B酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书
(96T)

使用前请仔细阅读说明书。若有任何问题,请联系我们。
              
试剂盒用途
该试剂盒用于体外定量检测大肠菌液体中重组羧肽酶B含量。本试剂盒仅供研究或工业生产使用。
 
试剂盒基本参数
灵敏度 =1 ng/ml
检测范围:0.25 - 64 ng/ml
特异性:可检测重组羧肽酶B,与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。
重复性:板内,板间变异系数均 < 10%。
工作时间:熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。
有效期:6个月
 
试剂盒组成及保存
未拆封的试剂盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用试剂盒,请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。
中文名称 规格 保存条件
抗体包被的ELISA酶标板(96孔可拆卸)
(MicroELISA Plate(Dismountable)
8孔×12条 -20℃
冻干标准品 (A1)
(Reference Standard)
32ng/支×4支 2-8℃
浓缩辣根过氧化物酶化抗体 (A2)(Concentrated HRP-Detection Ab) 1支×0.1 mL -20℃
标准品 & 样品稀释液(10X) (P1)
(Reference Standard & Sample Diluent(10X))
1瓶×5ml 2-8℃
HRP-抗体稀释液(10X) (P2)
(HRP- Ab Diluent(10X))
1瓶×5ml 2-8℃
浓缩洗涤液-1(25 X)(P3)
(Concentrated Wash Buffer (25x))
1瓶×40 mL 2-8℃
浓缩洗涤液-2(25 X)(P4)
(Concentrated Wash Buffer (25x)
1瓶×20 mL 2-8℃
显色底物(TMB)(A3)
(Substrate Reagent)
5支×0.125 mL -20℃ 避光
底物稀释液(TMB)(P5)
(Substrate Reagent)
1瓶×15 mL 2-8℃ 避光
反应终止液 (P6)(Stop Solution) 1瓶×15ml 2-8℃
封板覆膜(可重复使用)
(Plate Sealer)
5张  
产品说明书(User Manual) 1份  
质检报告(Certificate of Analysis) 1份  
 
说明:
1、所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。
2、酶标板-20℃可存放6个月,2-8℃存放勿超过一周。
 
试验所需自备物品
1.酶标仪(滤光片波长450 nm和650nm)
2.高精度移液器,EP管及一次性吸头,加样槽
3. 37℃恒温箱,双蒸水或去离子水
4.洁净无纸屑的吸水纸或干布
 
待测样品注意事项
1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或 -80℃(3个月内检测),避免反复冻融。
2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围,如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释后再测。
3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液,由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
 
检测前准备工作
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温,观察溶液是否有结晶,如果有结晶按提示进行操作。提前15分钟打开酶标仪预热。
2.稀释液配制
 将浓缩标准品 & 样品稀释液 或 浓缩HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释(1:10)。
3.洗涤液配制
将浓缩洗涤液-1 或 浓缩洗涤液-2用双蒸水稀释(1:25)。
 提示:从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超过50℃,使用时洗涤液温度应为室温)。请当日使用。
4.标准品配制
将标准品于1000转/分离心1分钟后,加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中,旋紧管盖,静置10分钟,上下颠倒数次,待其充分溶解后,用移液器将其轻轻混匀(浓度为32ng/ml), 然后进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。建议配制成以下浓度:  32168421、0.5、0 ng/ml样品稀释液直接作为空白孔0 ng/ml。
提示:溶解和稀释标准品过程中尽量避免产生气泡。
 
倍比稀释方法
取7只EP管,每管中加入500 μL标准品&样品稀释液,从32 ng/ml的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL标准品&样品稀释的EP管中混匀配成16 ng/ml的标准品工作液,按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。
标准品稀释图例(以500 μL为例)
 
提示:最后一管直接作为空白孔,不再加入标准品工作液。
 
5.HRP标记抗体工作液配制
实验前请先将抗体管1000转/分离心1分钟,以避免管壁及管盖上残留抗体实验前计算实验所需用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟,用HRP-抗体稀释液将浓缩辣根过氧化物酶化抗体稀释为工作浓度(抗体:稀释液 = 1:125),当日使用。
 
6. 显色底物(TMB)工作液配制
计算实验所需显色底物用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μL显色底物工作液。使用前15分钟,用底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度(底物:稀释液 =1:20),避光保存,当日使用。
 
方法
1. 自动洗板机:每孔加入洗涤液350-400 μL(根据加满孔的标准进行调整), 注入和吸出间隔60秒。
2. 手工洗板: 甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干,每孔加入洗涤液350-400 μL(根据加满孔的标准进行调整),浸泡2-3分钟,甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸上拍干。
 
操作步骤
1.将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔(复孔),每孔100 μL。待测样品加入到其他孔,每孔100 μL,若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。
提示加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。
2.洗涤:甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。每孔加入350-400 μL根据加满孔的标准进行调整洗涤液-1,浸泡2-3分钟,甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。重复此洗板步骤3次。
3.每孔中加入HRP-抗体工作液100 μL,轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡,将酶标板覆膜并置于37℃孵育30钟。    
4.洗涤:用 洗涤液-1 洗板3次,方法步骤同2。
5.洗涤:用 洗涤液-2 洗板2次,方法步骤同2。
提示:酶标板洗涤不完全可能会造成标准曲线梯度差,或背景值高。应注意加入洗涤液的体积,以加满酶标板的孔为标准进行调整,确保所有的孔浸泡在洗涤液中并浸泡2-3分钟。
 
6.显色:每孔加底物显色工作液(TMB)100 μL,将酶标板覆膜并置于37℃条件下孵育10分钟。
提示: 加显色底物推荐使用排枪和加样槽,但应严格避免底物污染,确保所使用的加样槽洁净或一次性使用,加液时移液枪的枪头切不要接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。可通过观察加样槽中底物是否变蓝预判底物是否被污染。根据实际显色情况酌情缩短或延长,显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。
7.终止:每孔加终止液50 μL,终止反应,室温放置1分钟,推荐使用排枪和加样槽。
提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头切不要接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。
8.读数:用酶标仪在450 nm波长(参考波长650nm)测量各孔的光密度(OD450/650 nm值)。
 提示: 请提前打开酶标仪电源,预热仪器,设置检测程序。
 
结果判断
1.计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标(X),OD值为纵坐标(Y),绘出标准曲线(作图时亦可去掉空白组的值)。
2.推荐使用专业的曲线制作软件,如curve expert 1.3或ELISA Calc(请使用Logistic五参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线)等。
3.若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测。
4.典型数据
由于实验操作条件的不同(如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等),标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
 
X-浓度(ng/mL) 32 16 8 4 2 1 0.5 0
Y-OD450/650nm 1.816 1.370 0.801 0.403 0.227 0.150 0.114 0.081
Y-OD450/650 nm(去本底) 1.735 1.289 0.720 0.322 0.146 0.069 0.033 0
回收量(ng/mL) 32.02 15.97 8.05 3.92 2.02 1.06 0.54
回收率% 100.1 99.8 100.6 98.0 101.0 106.0 108.0
 
  

注意事项
1、 储存:试剂盒中各种试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶需旋紧以防止蒸发和微生物污染,否则可能会出现错误的结果。
2、 酶标板:刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。暂时不用板条应拆下后放入备用自封袋,按推荐温度存放。
3、 加样:加样和加同一试剂时,第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间,从而明显的影响到测量值的准确性及重复性,每次的加样时间最好控制在10分钟之内。推荐设置复孔。
4、 温育:为防止样品蒸发,实验时必须给酶标板覆膜,洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。
5、 洗涤洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。在读数前要清除酶标板底部残留的液体和手指印,以免影响酶标仪读数。
6、 试剂配制试剂盒在运输过程中会使液体沾到管壁或瓶盖,因此使用1000转/分离心一分钟,以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前请用移液器小心吹打4-5次,使溶液混匀。所有试剂请按说明书指示请精确配制。
7、 时间的控制加入底物后,请定时观察反应孔的颜色变化(比如每隔五分钟),如梯度已经很明显,请提前加终止液终止反应,以避免颜色过深,影响酶标仪读数。
8、 底物:请避光保存底物。在储存和温育时,避免强光直接照射。
9、 混匀:充分轻微混匀对反应结果尤为重要,最好使用微量振荡器,使用最低频率,如无微量振荡器,可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
10、不同批号的试剂盒组分不能混用(洗涤液和终止液除外)。
 
问题分析
若实验结果有问题,请及时对显色结果拍照,并妥善保存未使用板条及试剂,然后联系技术支持。也可参考以下信息找出原因。
问题描述 可能原因 相应对策
 
标准曲线梯度差
吸液或加液不准 检查移液器和吸头
标准品稀释不正确 溶解标准品时稍微旋转瓶身,轻轻混匀使粉末完全溶解
洗涤不完全 保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量
显色很弱或无色 温育时间太短 保证充足的温育时间
实验温度不正确 使用推荐的实验温度
试剂体积不够或漏加 检查吸液及加液过程,保证所有试剂按顺序足量添加
稀释不正确
读数数值低 酶标仪设置不正确 在酶标仪上检查波长和滤光片装置
提前打开酶标仪预热
变异系数大 加液不正确 检查加液情况
 
 
 
背景值高
 
检测抗体的工作浓度过高 使用推荐的稀释倍数
 
酶标板洗涤不完全
重新仔细阅读操作步骤,保证每步清洗完全;如果用自动洗板机,请检查所有的出口是否有堵塞;是否使用试剂盒配备的洗涤液。
洗液有污染 配制新鲜的洗液
 
灵敏度低
ELZSA试剂盒保存不当 按说明书要求保存相关试剂
读数前未终止 OD读数前应在每孔中加入终止液
 
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