重组蛋白酶

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产品信息•重组蛋白酶

Honorary Certificate

重组胰蛋白酶试剂盒
重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书
(96T)

使用前请仔细阅读说明书和提示部分。若有任何问题,请联系我们。
              
1.试剂盒用途
本试剂盒用于体外定量检测待测样品中重组胰蛋白酶含量。本试剂盒仅供研究和工业生产使用。
 
2.试剂盒基本参数
灵敏度:≤ 1 ng/ml
检测范围:0.078 - 40 ng/ml
特异性:可检测重组胰蛋白酶,与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。
重复性:板内,板间变异系数均 < 10%。
工作时间:熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。
有效期:6个月
 
3.试剂盒组成及保存
未拆封的试剂盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用试剂盒,请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。
 
中文名称 规格 保存条件
冻干标准品 (A1)
(Reference Standard)
10ng/支×4支 2-8℃
标准品&样品稀释液 (P1)
(Reference Standard & Sample Diluent)
1瓶×5 mL 2-8℃
HRP-抗体稀释液 (P2)
(HRP- Ab Diluent)
1瓶×5 mL 2-8℃
浓缩洗涤液-1(25 X)(P3)
(Concentrated Wash Buffer (25x))
1瓶×40 mL 2-8℃
浓缩洗涤液-2(25 X)(P4)
(Concentrated Wash Buffer (25x))
1瓶×20 mL 2-8℃
底物稀释液(TMB)(P5) (Substrate Reagent) 1瓶×15 mL 2-8℃避光
反应终止液 (P6) (Stop Solution) 1瓶×15 mL 2-8℃
抗体包被的ELISA酶标板(96孔,可拆卸)
(MicroELISA Plate(Dismountable))
8孔×12条 -20℃
浓缩辣根过氧化物酶化抗体 (A2)
(Concentrated HRP-Detection Ab)
1支×0.05mL -20℃
显色底物(TMB)(A3) (Substrate Reagent) 5支×0.125 mL -20℃避光
封板覆膜(可重复使用)(Plate Sealer) 5张 /
产品说明书 (User Manual) 1份 /
质检报告 (Certificate of Analysis) 1份 /
 
 
说明:
1、所有试剂瓶须旋紧瓶盖以防止蒸发和微生物污染。
2、酶标板-20℃可存放6个月,2-8℃存放勿超过一周。
 
4.试验所需自备物品
1. 酶标仪(滤光片波长450 nm和650nm)
2. 高精度移液器,EP管及一次性吸头,加样槽
3. 37℃恒温箱,双蒸水或去离子水
4. 洁净无纸屑的吸水纸或干布
 
5.待测样品注意事项
1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或 -80℃(3个月内检测),避免反复冻融。
2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围,如果样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释后再测。
3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液,由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
 
6.检测前准备工作
①请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒平衡至室温,观察溶液是否有结晶,如果有结晶按提示进行操作。提前15分钟打开酶标仪预热。
②稀释液配制
浓缩标准品&样品稀释液 或 浓缩HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释(1:10)。
③洗涤液配制
浓缩洗涤液-1 或 浓缩洗涤液-2用双蒸水稀释(1:25)。
提示:从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超过50℃,使用时洗涤液温度应为室温)。请当日使用。
④标准品配制
将标准品于1000转/分离心1分钟后,加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中,旋紧管盖,静置10分钟后上下颠倒数次,待其充分溶解后,用移液器将其轻轻混匀(浓度为10 ng/mL), 然后进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。建议配制成以下浓度:10、 5、 2.5、 1.25、 0.63、0.312、0.156、0 ng/mL。标准品&样品稀释液直接作为空白孔0 ng/mL。
提示溶解和稀释标准品过程中尽量避免产生气泡。
倍比稀释方法
取7只EP管,每管加入500 μL标准品&样品稀释液,从10 ng/mL的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL标准品&样品稀释液的EP管中混匀配成5 ng/mL的标准品工作液,按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。
标准品稀释图例(以500 μL为例)
 
提示:最后一管直接作为空白孔,不再加入标准品工作液。
 
⑤HRP-抗体工作液配制 
实验前请先将抗体管1000转/分离心1分钟,以避免管壁及管盖上残留抗体。计算实验所需抗体用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μL工作液。使用前15分钟,用HRP-抗体稀释液浓缩辣根过氧化物酶化抗体稀释为工作浓度(抗体:稀释液 = 1:250),当日使用。
⑥显色底物(TMB)工作液配制
计算实验所需显色底物用量(以100 μL /孔计算),实际配制时应多配制100-200 μL显色底物工作液。使用前15分钟,用底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度(底物:稀释液 =1:20),避光保存,当日使用
提示:配制显色底物(TMB)工作液要严格避免污染,如出现变蓝的现象应重新配制。
 
7.洗板方法
①自动洗板机:每孔加入洗涤液350-400 μL根据加满孔的标准进行调整,注入和吸出间隔60秒。
②手工洗板:甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干,每孔加入洗涤液350-400 μL根据加满孔的标准进行调整,浸泡2-3分钟,甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸上拍干。
 
8.操作步骤
①将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔(复孔),每孔100 μL。待测样品加入到其他孔,每孔100 μL,若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。
提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内
②洗涤:甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。每孔加入350-400 μL根据加满孔的标准进行调整洗涤液-1,浸泡2-3分钟,甩尽孔内液体,在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。重复此洗板步骤3次。
③每孔加入HRP-抗体工作液100 μL,轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡,将酶标板覆膜并置于37℃孵育30分钟。
④洗涤:用洗涤液-1洗板3次,方法同步骤2。
⑤洗涤:用洗涤液-2洗板2次,方法同步骤2。
提示酶标板洗涤不完全可能会造成标准曲线梯度差,或背景值高。应注意加入洗涤液的体积,以加满酶标板的孔为标准进行调整,确保所有的孔浸泡在洗涤液中并浸泡2-3分钟。
⑥显色:每孔加显色底物(TMB)工作液100 μL,酶标板覆膜置于37℃ 孵育10分钟。
提示: 加显色底物推荐使用排枪和加样槽,但应严格避免底物污染,确保所使用的加样槽洁净或一次性使用,加液时移液枪的枪头切不要接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。可通过观察加样槽中底物是否变蓝预判底物是否被污染。根据实际显色情况酌情缩短或延长,显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。
⑦终止:每孔加终止液50 μL,终止反应,室温放置1分钟。推荐使用排枪和加样槽。
提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪的枪头切不要接触孔内溶液以避免污染,影响实验结果。
⑧读数:用酶标仪在450 nm波长(参考波长650nm)测量各孔的光密度(OD450/650 nm值)。
提示: 请提前15分钟打开酶标仪电源,预热仪器,设置检测程序。
 
9.结果判断
①计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标(X),OD值为纵坐标(Y),绘出标准曲线(作图时亦可去掉空白组的值)。
②推荐使用专业的曲线制作软件,如curve expert 1.3或ELISA Calc(请使用Logistic五参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线)等。
③若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测。
④典型数据
由于实验操作条件的不同(如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等),标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
 
 X-浓度(ng/mL) 10 5 2.5 1.25 0.625 0.312 0.156 0
Y-OD450/650 nm 1.601 1.454 1.231 0.872 0.624 0.382 0.244 0.057
Y-OD450/650 nm
(去本底)
1.574 1.397 1.174 0.815 0.567 0.325 0.187 0
回收量(ng/mL) 10.167 4.822 2.628 1.182 0.657 0.306 0.153
回收率% 101.7 96.4 105.1 94.6 105.1 98.1 98.1
 
  
 
10.注意事项
储存:试剂盒中各种试剂请按说明书提示合理存放。储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶需旋紧以防止蒸发和微生物污染,否则可能会出现错误结果。
酶标板:刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响。暂时不用板条应拆下后放入备用自封袋,按推荐温度存放。
加样:加样和加同一试剂时,第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间,从而明显的影响到测量值的准确性及重复性,每次的加样时间最好控制在10分钟之内,推荐设置复孔。
温育:为防止样品蒸发,实验时必须给酶标板覆膜,洗板后应尽快进行下步操作,避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。
洗板:洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸或干布上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。读数前要清除酶标板底部残留的液体和手指印,以免影响酶标仪读数。
试剂配制:试剂盒在运输过程中会使液体沾到管壁或瓶盖,因此使用1000转/分离心一分钟,以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。所有试剂请按说明书指示请精确配制。
显色时间的控制:加入底物后,请定时观察反应孔的颜色变化(比如每隔五分钟),如梯度已经很明显,请提前加终止液终止反应,以避免颜色过深,影响酶标仪读数。
底物:请避光保存底物。在储存和温育时,避免强光直接照射。
混匀:充分轻微混匀对反应结果尤为重要,最好使用微量振荡器,使用最低频率,如无微量振荡器,可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
提示不同批号的试剂盒组分不能混用(洗涤液和终止液除外)。
 
11.问题分析
若实验结果有问题,请及时对显色结果拍照,并妥善保存未使用板条及试剂,然后联系技术支持。也可参考以下信息以找出原因。
 
问题描述 可能原因 相应对策
标准曲线梯度差 吸液或加液不准 检查移液器和吸头
标准品稀释不正确 溶解标准品时稍微旋转瓶身,轻轻混匀使粉末完全溶解
酶标板洗涤不完全 保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量
显色很弱或无色 温育时间太短 保证充足的温育时间
实验温度不正确 使用推荐的实验温度
试剂体积不够或漏加 检查吸液及加液过程,保证所有试剂按顺序足量添加
稀释不正确
读数数值低 酶标仪设置不正确 在酶标仪上检查波长和滤光片装置
提前打开酶标仪预热
变异系数大 加液不正确 检查加液情况
背景值高 检测抗体的工作浓度过高 使用推荐的稀释倍数
酶标板洗涤不完全 重新仔细阅读操作步骤,保证每步清洗完全;如果用自动洗板机,请检查所有的出口是否有堵塞;是否使用试剂盒配备的洗涤液。
洗液有污染 配制新鲜的洗液
灵敏度低 ELZSA试剂盒保存不当 按说明书要求保存相关试剂
读数前未终止 OD读数前应在每孔中加入终止液
 
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